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傳統(tǒng)的代謝物酶法測(cè)定分為終點(diǎn)法和動(dòng)力學(xué)法。

酶的作用有特異性，成分復(fù)雜的血清等體液樣品往往不需進(jìn)行預(yù)處理，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序。

酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，沒(méi)有毒性，這樣就避免了環(huán)境污染。酶促反應(yīng)的條件溫和，制成試劑盒可適用于自動(dòng)分析。

1.代謝物酶促終點(diǎn)法測(cè)定

在代謝物酶促反應(yīng)中，隨著時(shí)間的延續(xù)，待測(cè)物濃度逐漸減少，產(chǎn)物逐漸增多，一定時(shí)間后待測(cè)物全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，反應(yīng)趨于平衡。

測(cè)定反應(yīng)完全后（反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)）待測(cè)物或產(chǎn)物變化的總量，即終點(diǎn)法，又稱(chēng)平衡法。

代謝物濃度酶促終點(diǎn)法測(cè)定的基本條件是：

①待測(cè)物濃度[S]應(yīng)遠(yuǎn)小于其米氏常數(shù)K m ，此時(shí)任何時(shí)刻的反應(yīng)速度ν=V[S]/K m ，呈一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；

②反應(yīng)配方中所用酶量應(yīng)足夠大，而Km應(yīng)小，以保證有較快的反應(yīng)速度完成測(cè)定。

(1)一步法

如果待測(cè)物與產(chǎn)物在理化性質(zhì)上有便于檢測(cè)的差異，如吸收光譜不同則可直接測(cè)定待測(cè)物或產(chǎn)物本身信號(hào)的改變來(lái)進(jìn)行定量分析，這種是最簡(jiǎn)單的底物法測(cè)定。

(2)酶促偶聯(lián)法

如果酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物沒(méi)有可直接檢測(cè)的成分，則可將反應(yīng)某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個(gè)酶促反應(yīng)中，而達(dá)到檢測(cè)的目的。

一般把第一步反應(yīng)稱(chēng)為輔助反應(yīng)，所用工具酶叫輔助酶，偶聯(lián)的反應(yīng)稱(chēng)為指示反應(yīng)，指示反應(yīng)所用的工具酶叫指示酶。

偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)設(shè)計(jì)為非限速反應(yīng)。

(3)最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個(gè)

以脫氫酶為指示系統(tǒng)的酶促反應(yīng)，不管是終點(diǎn)法測(cè)定，還是動(dòng)力學(xué)法測(cè)定，共同的缺陷是受到內(nèi)源性脫氫酶及其底物 如乳酸脫氫酶和乳酸/丙酮酸的干擾。

為了消除乳酸脫氫酶的干擾，在反應(yīng)設(shè)計(jì)時(shí)一般采用加入乳酸脫氫酶的抑制劑的方法來(lái)解決。

終點(diǎn)法還受到乳糜、黃疸和溶血的影響，測(cè)定時(shí)需設(shè)定樣品空白。

終點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的問(wèn)題：

①所用工具酶的特異性。

②酶對(duì)待測(cè)物的親和力，在保證測(cè)定線(xiàn)性的前提下，Km要盡量小。

③酶的用量要足夠大。

④工具酶中的雜酶應(yīng)低于允許限。

⑤反應(yīng)平衡點(diǎn)：應(yīng)創(chuàng)造條件使反應(yīng)朝正反應(yīng)方向進(jìn)行。

⑥試劑中的附加劑(如穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑)，不應(yīng)抑制酶的活性。

2.動(dòng)力學(xué)法測(cè)定

總單位時(shí)間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物增加的量。

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