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傳統(tǒng)的代謝物酶法測定分為終點法和動力學法。

酶的作用有特異性，成分復雜的血清等體液樣品往往不需進行預處理，簡化了實驗程序。

酶的本質是蛋白質，沒有毒性，這樣就避免了環(huán)境污染。酶促反應的條件溫和，制成試劑盒可適用于自動分析。

1.代謝物酶促終點法測定

在代謝物酶促反應中，隨著時間的延續(xù)，待測物濃度逐漸減少，產物逐漸增多，一定時間后待測物全部轉化為產物，反應趨于平衡。

測定反應完全后（反應達到平衡時）待測物或產物變化的總量，即終點法，又稱平衡法。

代謝物濃度酶促終點法測定的基本條件是：

①待測物濃度[S]應遠小于其米氏常數(shù)K m ，此時任何時刻的反應速度ν=V[S]/K m ，呈一級反應動力學；

②反應配方中所用酶量應足夠大，而Km應小，以保證有較快的反應速度完成測定。

(1)一步法

如果待測物與產物在理化性質上有便于檢測的差異，如吸收光譜不同則可直接測定待測物或產物本身信號的改變來進行定量分析，這種是最簡單的底物法測定。

(2)酶促偶聯(lián)法

如果酶促反應的底物或產物沒有可直接檢測的成分，則可將反應某一產物偶聯(lián)到另一個酶促反應中，而達到檢測的目的。

一般把第一步反應稱為輔助反應，所用工具酶叫輔助酶，偶聯(lián)的反應稱為指示反應，指示反應所用的工具酶叫指示酶。

偶聯(lián)反應應設計為非限速反應。

(3)最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個

以脫氫酶為指示系統(tǒng)的酶促反應，不管是終點法測定，還是動力學法測定，共同的缺陷是受到內源性脫氫酶及其底物 如乳酸脫氫酶和乳酸/丙酮酸的干擾。

為了消除乳酸脫氫酶的干擾，在反應設計時一般采用加入乳酸脫氫酶的抑制劑的方法來解決。

終點法還受到乳糜、黃疸和溶血的影響，測定時需設定樣品空白。

終點法實驗設計應考慮的問題：

①所用工具酶的特異性。

②酶對待測物的親和力，在保證測定線性的前提下，Km要盡量小。

③酶的用量要足夠大。

④工具酶中的雜酶應低于允許限。

⑤反應平衡點：應創(chuàng)造條件使反應朝正反應方向進行。

⑥試劑中的附加劑(如穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑)，不應抑制酶的活性。

2.動力學法測定

總單位時間內底物減少或產物增加的量。

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