［關(guān)鍵詞］ 腫瘤；微轉(zhuǎn)移；機(jī)制；檢測

　　The Mechanisms and Detection of Tumour Micrometastasis

　　Key words： Tumor； Micrometastasis；Mechanisms；Detection

　　轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一，也是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。近幾年，腫瘤轉(zhuǎn)移的研究已發(fā)展到細(xì)胞及分子水平，腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念也已逐步建立。準(zhǔn)確判斷有無腫瘤轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的范圍，可大大提高腫瘤治療的有效率，改善患者的預(yù)后。然而，臨床及常規(guī)病理檢查很難發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，只有通過免疫組化或PCR等特殊檢查才能確定。本文就腫瘤微轉(zhuǎn)移的機(jī)制及檢測途徑作一簡要綜述。

　　1.微轉(zhuǎn)移的概念

　　自1869年首次報(bào)道并證實(shí)外周血中發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞以來，微轉(zhuǎn)移的研究逐漸成為腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。微轉(zhuǎn)移（micrometastases）是指在各種機(jī)體組織、體液及細(xì)胞移植物中檢測到的鏡下及亞顯微水平的腫瘤殘留，是用常規(guī)臨床病理學(xué)方法不能檢出的、隱匿在原發(fā)灶以外組織的、非血液系統(tǒng)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移［1］。1993年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）出版的《腫瘤TNM分期補(bǔ)充材料》中指出，當(dāng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶生長至直徑1 mm～2 mm時(shí)，稱作微轉(zhuǎn)移。

　　2.腫瘤微轉(zhuǎn)移的機(jī)制

　　關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移存在兩種學(xué)說，一是“種子與土壤假說”：認(rèn)為是否形成腫瘤轉(zhuǎn)移要看被轉(zhuǎn)移部位組織的環(huán)境是否適宜原發(fā)瘤細(xì)胞的停留和生長。這種學(xué)說認(rèn)為，人體大部分轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞由于受到免疫機(jī)制的殺傷或者轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞局部環(huán)境不適宜而不能存活；只有少數(shù)細(xì)胞具有活力，在轉(zhuǎn)移部位組織生長繁殖，形成轉(zhuǎn)移瘤［2］。二是腫瘤異質(zhì)性理論：該理論認(rèn)為由于瘤細(xì)胞遺傳性狀的不穩(wěn)定，由單克隆起源的瘤細(xì)胞在不斷增殖的過程中會發(fā)生異質(zhì)性，導(dǎo)致瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有高低之分［3］。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，其轉(zhuǎn)移主要有3種途徑：經(jīng)血道轉(zhuǎn)移、經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移、直接侵及周圍組織器官和播散至體腔。腫瘤淋巴管、細(xì)胞因子的作用以及微環(huán)境的影響對原發(fā)瘤播散至遠(yuǎn)處組織器官起了很大的作用。

　　2.1  腫瘤淋巴管生成  由于毛細(xì)淋巴管無完整的基底膜，管壁薄，內(nèi)皮細(xì)胞間有短暫裂隙，通透性高，有利于瘤細(xì)胞的進(jìn)入，故在早期腫瘤轉(zhuǎn)移以淋巴道為主。淋巴管不僅參與腫瘤錨定生長所必需的基質(zhì)成分的形成，而且當(dāng)腫瘤實(shí)體長到1 mm～2 mm 時(shí)，腫瘤血管生成的過程也需要淋巴管參與。腫瘤缺氧壞死也與缺乏完善的淋巴管系統(tǒng)有密切關(guān)系，前哨淋巴結(jié)的活檢已被應(yīng)用于一些惡性腫瘤（如乳腺癌和黑色素瘤） 的診斷和分期。近期有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤新生淋巴管是淋巴道轉(zhuǎn)移的主要原因，且在淋巴管生成中淋巴管生成因子VEGFC和VEGFD起著關(guān)鍵作用。在人的某些自發(fā)性癌轉(zhuǎn)移模型和一些動物實(shí)驗(yàn)中證明VEGFC和VEGFD有促進(jìn)腫瘤新生淋巴管形成的能力［4］。隨著對VEGFC和VEGFD研究的逐步深入，有學(xué)者［5］認(rèn)為VEGFD的表達(dá)在某些腫瘤中與新生淋巴管的形成成負(fù)相關(guān)。目前，在實(shí)體瘤中淋巴管的存在與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系上仍然存在較大分歧，Leu 等［6］認(rèn)為腫瘤中缺乏功能性淋巴管，而McCarter 等［7］則認(rèn)為，淋巴管的生成是一個(gè)成功的腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉屑~。

　　2.2  細(xì)胞因子的作用  惡性細(xì)胞間的相互粘著力較正常細(xì)胞間低，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落， 侵入細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜中大分子蛋白粘附，啟動細(xì)胞合成并分泌各種降解酶類，降解基底膜（BM）及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），穿過脈管壁進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在循環(huán)中逃避免疫系統(tǒng)攻擊，最后穿過脈管，外滲達(dá)繼發(fā)部位形成克隆，增殖形成轉(zhuǎn)移灶。癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中，需2次侵襲周圍組織，2次穿越血管和淋巴管基底膜。在此過程中有多種因子參與：運(yùn)動因子如分裂素能刺激細(xì)胞的遷移、趨化、吞噬等；細(xì)胞粘附因子（Cell Adhesion Molecules，CAMS ）如整合蛋白、鈣粘蛋白、免疫球蛋白超家族及選擇素是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞，細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)粘附和相互作用的轉(zhuǎn)膜糖蛋白，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移；腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的胞外基質(zhì)降解酶如組織蛋白酶、金屬蛋白酶等可降解基質(zhì)使腫瘤細(xì)胞易于遷移； 歸巢因子中的尋址素和歸巢受體是一組能幫助腫瘤細(xì)胞找尋轉(zhuǎn)移靶器官的因子，位于癌細(xì)胞的歸巢受體與位于內(nèi)皮細(xì)胞的尋址素共同作用，使癌細(xì)胞離開血循環(huán)到達(dá)特定的器官；新近又發(fā)現(xiàn)一類誘導(dǎo)細(xì)胞移動的趨化因子（Chemokines），可直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和生長，調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞定向移動，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。［醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)  搜集整理］

　　2.3  微環(huán)境的影響  微環(huán)境因素以及腫瘤和宿主細(xì)胞間生物鏈對決定微轉(zhuǎn)移灶的生存和生長可能具有關(guān)鍵的作用。一定的微環(huán)境對于一些腫瘤的繁殖可能是有利的，但對于其他腫瘤則是不利的，具有明顯的器官傾向性。同時(shí)有動物實(shí)驗(yàn)證明，將不同的瘤細(xì)胞經(jīng)靜脈接種于大鼠體內(nèi)，其轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生部位不同，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明不同的瘤細(xì)胞在不同臟器內(nèi)轉(zhuǎn)移的分布上有明顯的不同，對于每一種腫瘤都是高度特異的［8］。瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的器官特異性是由于轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞高表達(dá)靶器官內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的粘附分子的配體， 腫瘤細(xì)胞與靶器官內(nèi)皮細(xì)胞特異性粘附以及靶器官內(nèi)生長因子對腫瘤細(xì)胞生長的影響，是構(gòu)成器官特異性轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制［9］。各種腫瘤和宿主微環(huán)境之間關(guān)系不會完全一樣，因而在器官特異性轉(zhuǎn)移過程中，在不同器官中起主要作用的瘤細(xì)胞或宿主靶器官作用的特殊性也有所不同。

　　3. 腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測

　　目前，在臨床上，許多惡性腫瘤的原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移灶雖然經(jīng)手術(shù)根治切除，甚至常規(guī)病理學(xué)檢查為轉(zhuǎn)移陰性的患者，部分仍死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。這可能與已存在的血循環(huán)、骨髓、淋巴道和不同組織器官的腫瘤微轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此，腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測具有重要意義。選擇合適的方法及腫瘤標(biāo)志物，可明顯提高微轉(zhuǎn)移的檢出率。

　　3.1  常規(guī)連續(xù)切片HE染色法  連續(xù)切片法一般用于淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移檢測，其檢出率與切片間距有很大關(guān)系，連續(xù)切片的細(xì)致分析，可從常規(guī)單張切片檢查陰性的淋巴結(jié)中檢出10%左右的微轉(zhuǎn)移［10］，而連續(xù)切片法一個(gè)標(biāo)本需切幾十至幾百張切片，工作量大，臨床難以推廣，且對未形成轉(zhuǎn)移灶的少量癌細(xì)胞難以檢出，故近年來已很少使用。

　　3.2  免疫組化法  腫瘤細(xì)胞均具有各自特異的細(xì)胞標(biāo)志物，免疫組化法就是選用針對腫瘤細(xì)胞特異標(biāo)志物的抗體，用顯色劑標(biāo)記，在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng)，對組織切片、細(xì)胞涂片進(jìn)行染色，以尋找組織、血液、淋巴結(jié)、骨髓中的腫瘤細(xì)胞，以達(dá)到微轉(zhuǎn)移檢測的目的，并且可直接觀察微轉(zhuǎn)移細(xì)胞的形態(tài)。由于操作較簡便，成本相對較低， 敏感性和特異性較高， 該技術(shù)較早應(yīng)用于臨床。該方法的不足之處在于費(fèi)時(shí)，費(fèi)用較昂貴，且因單抗之間存在交叉反應(yīng)， 腫瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)分布的不均質(zhì)性、存在實(shí)際陽性染色結(jié)果判斷操作的標(biāo)準(zhǔn)化問題，易出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果。特異性抗體也可用熒光標(biāo)記，采用附計(jì)算機(jī)裝置的熒光顯微鏡對免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行掃描，可消除內(nèi)源性堿性磷酸酶的影響，確定腫瘤細(xì)胞的絕對數(shù)目，微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞具有特異性免疫熒光可存盤，進(jìn)一步作形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)以及分子和細(xì)胞遺傳學(xué)分析。

　　3.3  流式細(xì)胞術(shù)  流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry ， FCM）的基本原理是用熒光標(biāo)記的單抗與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，通過流式細(xì)胞儀即可檢測到腫瘤細(xì)胞，其最大優(yōu)點(diǎn)是可以對骨髓樣品中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，并且能夠?qū)⑦@些細(xì)胞分離進(jìn)行進(jìn)一步研究［11］。這一過程是完全自動化的，排除了主觀因素的干擾。孫玲等［12］ 利用FCM檢測96例非小細(xì)胞肺癌患者骨髓微轉(zhuǎn)移，并且以非癌患者和正常人為對照，以實(shí)驗(yàn)組樣品細(xì)胞FI值大于對照組細(xì)胞表達(dá)熒光強(qiáng)度的上限值（±2S）判為陽性，結(jié)果經(jīng)手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)前骨髓微轉(zhuǎn)移檢出率為26%.該方法雖然能進(jìn)行細(xì)胞定量計(jì)數(shù)，但不能提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)依據(jù)，同時(shí)由于儀器昂貴，非普通實(shí)驗(yàn)室所能承受，限制了該技術(shù)的推廣。

　　3.4  聚合酶鏈反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR和 RTPCR）  該技術(shù)的原理是通過在患者的血液、淋巴結(jié)、骨髓中擴(kuò)增出腫瘤細(xì)胞標(biāo)志性基因或靶RNA來證實(shí)腫瘤細(xì)胞的存在。應(yīng)用PCR技術(shù)可擴(kuò)增存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的異常DNA，首先要明確原發(fā)灶內(nèi)有無腫瘤細(xì)胞基因突變以及突變類型，若未測得突變則不能應(yīng)用PCR技術(shù)對待測轉(zhuǎn)移位點(diǎn)進(jìn)行微轉(zhuǎn)移檢測。RTPCR技術(shù)是通過擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞特異的或組織特異的標(biāo)志物基因信使RNA來檢測腫瘤細(xì)胞的存在的。RTPCR 檢測腫瘤基因標(biāo)志物是目前認(rèn)為最適于發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的方法，其靈敏度可達(dá)10-7～10-8 ，尤其適用于微量樣本中目的基因的獲取或微量腫瘤細(xì)胞的檢測。用免疫組化等方法檢測結(jié)果為陰性時(shí)，仍可用組織特異性標(biāo)志物信使RNA檢測來表明腫瘤細(xì)胞的存在。PCR 技術(shù)用于檢測基因的表達(dá)，所需樣品少、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)，但也有其不足，如不能確定是否存在活的腫瘤細(xì)胞，外源基因污染、假基因干擾、RNA 的非法轉(zhuǎn)錄可致假陽性，而基因表達(dá)產(chǎn)物變異、取材的局限等可致假陰性。同時(shí)，RTPCR 的靈敏度極大程度上取決于所擴(kuò)增的對象（即靶RNA） 的特異性，但目前絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞缺乏其特異性信使RNA ， 實(shí)驗(yàn)操作上也有待于進(jìn)一步標(biāo)化。隨著新的腫瘤特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，RTPCR有可能成為檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移的常規(guī)方法。

　　3.5  免疫磁分離  新近建立的用于改進(jìn)循環(huán)單個(gè)瘤細(xì)胞檢測的方法，采用FITC結(jié)合抗全細(xì)胞角蛋白單克隆抗體陽性細(xì)胞，與超順磁抗FITC微珠耦聯(lián)，然后進(jìn)入高梯度磁場與免疫磁性活化細(xì)胞篩選機(jī)。富集的樣本準(zhǔn)備作FCM、免疫熒光術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)或RTPCR檢測［13，14］。Park 等［15，16］應(yīng)用磁珠包被的抗CEA 單抗分離腫瘤患者外周血中瘤細(xì)胞，然后進(jìn)行RTPCR ，并以常規(guī)RTPCR 作對照， 結(jié)果免疫磁珠RTPCR 和常規(guī)RTPCR 在1 ml外周血中檢出癌細(xì)胞的數(shù)量分別為101 和102 ，因此認(rèn)為免疫磁珠RTPCR 診斷微轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性優(yōu)于常規(guī)RTPCR.免疫磁分離可提高微轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞檢測的敏感性，從而減少假陽性和假陰性。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程。因此對腫瘤微轉(zhuǎn)移的研究也是一項(xiàng)復(fù)雜的工程。通過對腫瘤微轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究，可以尋找更科學(xué)、有效的腫瘤治療方案，以提高臨床治愈率，而微轉(zhuǎn)移的檢測無疑對建立個(gè)體化的治療方案具有重要作用。如果我們能在微轉(zhuǎn)移時(shí)得到明確診斷并給以針對性治療，可望將具有微轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞扼殺在轉(zhuǎn)移形成的早期，讓治療發(fā)揮最大的功效，這對減少術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的形成，爭取良好的預(yù)后有重要作用。在對腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測中，針對不同類型的腫瘤、不同的標(biāo)本，選取不同的檢測方法，同時(shí)對現(xiàn)有的檢測方法進(jìn)行不斷改進(jìn)與革新，并進(jìn)一步研究新的檢測技術(shù)，我們相信，隨著對腫瘤微轉(zhuǎn)移機(jī)制和檢測方法的深入研究，在不久的將來，將會給腫瘤的診斷、治療帶來根本性的變化。

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