1．通過(guò)觀察、檢測(cè)龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸含量,與對(duì)大鼠急性腎功能損傷和形態(tài)學(xué)的影響，探討龍膽瀉肝丸降低腎毒性的作用。方法用含相當(dāng)生藥關(guān)木通3 g、6 g、12 g/（kg*d）的龍膽瀉肝丸水煎液給大鼠連續(xù)灌胃7天,檢測(cè)各組大鼠體質(zhì)量、腎功能及腎組織形態(tài)學(xué)變化；并用RP-HPLC測(cè)定龍膽瀉肝丸、關(guān)木通水煎液馬兜鈴酸含量.結(jié)果

① 龍膽瀉肝丸水煎液組馬兜鈴酸含量明顯低于關(guān)木通水煎液組（P<0.01）.

② 龍膽瀉肝丸有減低關(guān)木通腎毒性作用。結(jié)論龍膽瀉肝丸有降低關(guān)木通腎毒性作用，與馬兜鈴酸含量降低有關(guān).

2．目前市售龍膽瀉肝丸和含馬兜鈴酸藥物如關(guān)木通等中藥的安全性問(wèn)題十分引人關(guān)注。本研究比較和評(píng)價(jià)了連續(xù)給予按近期中國(guó)藥典生產(chǎn)的龍膽瀉肝丸,關(guān)木通，三葉木通及五葉木通對(duì)小鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及程度,以提供木通類藥物和龍膽瀉肝丸的安全性資料，確定毒性劑量范圍,為臨床用藥提供參考。方法龍膽瀉肝丸、關(guān)木通、三葉木通及五葉木通對(duì)小鼠連續(xù)灌胃28d,觀察小鼠的一般情況、進(jìn)行血液生化學(xué)、病理組織學(xué)檢查等。剩余1/2小鼠進(jìn)行停藥25d恢復(fù)期觀察。結(jié)果龍膽瀉肝丸組在整個(gè)試驗(yàn)期間未見(jiàn)明顯的毒性反應(yīng)，無(wú)毒性反應(yīng)劑量為〉3.00g/（kg.d）。關(guān)木通的無(wú)毒性反應(yīng)劑量為0.06g/（kg.d）；在〉=0.24g/（kg.d）時(shí)見(jiàn)體重增長(zhǎng)緩慢,耗食量減少，肝、腎功能指標(biāo)異常,高劑量組明顯。病理觀察可見(jiàn)明顯的腎臟毒性，如腎近曲小管明顯擴(kuò)張,小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎間質(zhì)炎癥及明顯的纖維化。腎臟病變停藥后仍不能完全恢復(fù)。三葉木通和五葉木通組在整個(gè)試驗(yàn)期間未見(jiàn)與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng),無(wú)毒性反應(yīng)劑量分別為0.40和〉10.00g/（kg.d）。結(jié)論在本試驗(yàn)條件下，關(guān)木通顯示出明顯的腎臟毒性,其出現(xiàn)毒性的劑量為0.24g/（kg.d），等于臨床用量;而龍膽瀉肝丸、三葉木通和五葉木通未見(jiàn)與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng),其無(wú)毒性反應(yīng)劑量為臨床用量的5-25倍。

3．本研究將根據(jù)中醫(yī)臨床肝膽濕熱的主要客觀表現(xiàn)，參考現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的膽汁淤積的形成機(jī)理，建立模擬肝膽濕熱的動(dòng)物模型，并對(duì)該模型的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探討。在該模型的基礎(chǔ)上研究龍膽瀉肝丸的治療肝膽濕熱的作用及其機(jī)理。目的：首先采用ANIT建立模擬中醫(yī)臨床的肝膽濕熱模型，探討該模型在膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)代謝方面的分子機(jī)制。以該模型為基礎(chǔ)，觀察龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的作用機(jī)理，探討作用靶點(diǎn)，從而為龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱提供科學(xué)依據(jù)。

方法：

實(shí)驗(yàn)一、大鼠肝膽濕熱模型的建立 將10只大鼠分為對(duì)照組和模型組，每組5只。模型組按100mg/kg的劑量一次性灌胃給予α-萘異硫氰酸酯（ANIT）花生油，對(duì)照組灌胃同體積花生油。造模后72h，大鼠一一行膽管插管術(shù)。收集4 h內(nèi)的膽汁，按照收集的時(shí)間段計(jì)算膽汁分泌量。造模后76h檢測(cè)血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽固醇（CHO）水平以及肝組織病理變化。此外，將另外5只大鼠分別于灌胃ANIT后12h、24h、48h、72h、96h分別處死一只。另取1只作為正常對(duì)照。分別于不同時(shí)間點(diǎn)，取出肝臟，提取肝組織總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)MDR1b及MRP2 mRNA的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)二、觀察龍膽瀉肝丸（LD）對(duì)肝膽濕熱模型大鼠和小鼠的清利肝膽作用 將72只大鼠分為6組，分別為對(duì)照組，模型組，膽樂(lè)膠囊（DL）組和LD 10、5.0、2.5g生藥/kg劑量組。LD各劑量組和DL組每日給藥1次，連續(xù)給藥8天。對(duì)照組灌胃同體積花生油。于給藥期間的第5天，除了對(duì)照組外，其余各組在給藥后間隔1 h再灌胃給予ANIT 100 mg/kg（僅一次）。于第8天末次給藥后30 min（末次給藥前禁食24 h，不禁水），行膽管插管，收集4 h內(nèi)的膽汁，按照收集的時(shí)間段計(jì)算膽汁分泌量。并檢測(cè)血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、CHO、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平以及肝組織病理變化。另外72只小鼠按同樣方法復(fù)制模型，最后檢測(cè)血清TBIL、DBIL水平。

實(shí)驗(yàn)三、觀察龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表達(dá)的影響 將20只大鼠分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、LD 5.0、2.5 g生藥/kg劑量組。給藥組均于動(dòng)物處死前8天開始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)8天。對(duì)照組和模型組灌胃同體積的蒸餾水。其中第5天給藥1h后，除對(duì)照組給予花生油灌胃外，其他各組大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天取出肝臟。提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2 mRNA的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)四、觀察龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠中性粒細(xì)胞CD18表達(dá)的影響 將20只大鼠分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、LD 5.0、2.5 g生藥/kg。給藥組均于動(dòng)物處死前8天開始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)8天。對(duì)照組和模型組灌胃同體積的蒸餾水。其中第5天給藥1h后，除對(duì)照組花生油灌胃外，其他各組大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天眼眶靜脈取100μl抗凝血，加入PE標(biāo)記的CD18抗體，流式細(xì)胞儀測(cè)中性粒細(xì)胞CD18表達(dá)，另取血20μl血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)白細(xì)胞及粒細(xì)胞總數(shù)。

結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)一：大鼠肝膽濕熱模型的建立結(jié)果顯示，模型組給予ANIT 72h后，大鼠膽汁分泌量在膽管插管后4h內(nèi)一直顯著低于對(duì)照組（P0.05或P0.01），而血清TBIL、DBIL、CHO、ALT、AST、ALP水平明顯高于對(duì)照組。組織形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)模型組出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和膽管損傷。對(duì)照組大鼠MDR1b mRNA無(wú)明顯表達(dá)，MRP2 mRNA只有較弱表達(dá)。模型組大鼠在造模后48h～96h，MDR1b mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，但在造模后24h內(nèi)表達(dá)不明顯。造模后12h、24h，MRP2 mRNA表達(dá)較弱，而在造模后48h～96h均表達(dá)明顯。

實(shí)驗(yàn)二：龍膽瀉肝丸（LD）對(duì)肝膽濕熱模型大鼠和小鼠的清利肝膽作用

1．膽汁分泌結(jié)果顯示，模型組的膽汁分泌量較對(duì)照組顯著降低（P0.05）。LD各給藥組膽汁分泌量不同程度地高于模型組。LD 5.0g生藥/kg組、LD2.5g生藥/kg組在1h和1.5h時(shí)間點(diǎn)的膽汁排泌量較模型組顯著增高（P0.05），其它時(shí)間點(diǎn)也有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．血清TBIL、DBIL、CHO水平 模型組大鼠血清TBIL、DBIL、CHO水平均上升，與對(duì)照組比較有明顯差異（P0.01）。而LD 5.0g生藥/kg組、LD2.5g生藥/kg組血清TBIL、DBIL、CHO與模型組比較有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3．血清ALT、AST、ALP 模型組大鼠血清ALT、AST、ALP升高，與對(duì)照組比較有明顯差異（P0.01）。LD各劑量組的血清ALT、AST、ALP水平均與模型組比較無(wú)差異。

4．血清MDA、SOD、GSH水平 模型組大鼠血清MDA水平升高（與對(duì)照組比較P0.01），血清SOD及GSH水平與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。LD各劑量組血清SOD、GSH水平與模型組比較無(wú)明顯差異。LD對(duì)血清MDA有降低趨勢(shì)（與對(duì)照組比較P0.05）。

5．肝臟組織形態(tài)學(xué) 各給藥組肝細(xì)胞壞死不同程度的輕于模型組，其中LD 2.5g生藥/kg組分別與模型組相比差異顯著（P0.01）。

實(shí)驗(yàn)三：龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表達(dá)的影響

1．肝組織MDR1a、MDR1b、MDR 2 mRNA表達(dá)模型組大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，肝組織MDR1a、MDR1b mRNA表達(dá)顯著增加（P0.05，P0.01）。MDR2 mRNA也增加，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LD 5.0g生藥/kg和LD 2.5g生藥/kg對(duì)肝膽濕熱模型大鼠的肝組織MDR1a、MDR1b、MDR2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。

2．肝組織MRP1 mRNA和MRP2 mRNA表達(dá)模型組大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，MRP2 mRNA表達(dá)下降，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MRP1 mRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（P0.05）。LD 5.0g生藥/kg和LD 2.5g生藥/kg對(duì)肝膽濕熱模型大鼠的肝組織MRP1、MRP2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。

實(shí)驗(yàn)四：龍膽瀉肝丸對(duì)肝膽濕熱大鼠中性粒細(xì)胞CD18表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，LD各給藥組白細(xì)胞總數(shù)以及粒細(xì)胞總數(shù)有下降趨勢(shì)，CD18熒光強(qiáng)度明顯低于模型組。

結(jié)論：通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為，通過(guò)灌胃ANIT，所建立的模型具有肝內(nèi)、體內(nèi)膽汁淤積，肝酶水平增高，肝細(xì)胞損傷等病理生理特征，與中醫(yī)臨床上以身目黃疸為主要表現(xiàn)的肝膽濕熱證類似，可以作為肝膽濕熱模型。該模型的肝臟組織中MDR及MRP mRNA表達(dá)發(fā)生變化，而MDR及MRP是與膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)代謝有關(guān)的分子。說(shuō)明MDR及MRP參與該肝膽濕熱模型的形成。龍膽瀉肝丸能增加膽汁流量，加速膽汁排出，但是對(duì)膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)代謝分子MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2等均無(wú)顯著影響。結(jié)果提示，龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的作用機(jī)制可能與增加毛細(xì)膽管膽汁流量、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、穩(wěn)定細(xì)胞膜、阻抑CD11/CD18介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附有關(guān)。