細菌細胞的70S核糖體是合成蛋白質的主要細胞成分，它包括50S和30S兩個亞基。氯霉素通過可逆地與50S亞基結合,阻斷轉肽酰酶的作用，干擾帶有氨基酸的胺基酰-tRNA終端與50S亞基結合，從而使新肽鏈的形成受阻，抑制蛋白質合成。由于氯霉素還可與人體線粒體的70S結合,因而也可抑制人體線粒體的蛋白合成，對人體產生毒性。因為氯霉素對 70S核糖體的結合是可逆的，故被認為是抑菌性抗生素，但在高藥物濃度時對某些細菌亦可產生殺菌作用，對流感桿菌甚至在較低濃度時即可產生殺菌作用。