高效液相色譜法（HPLC）是目前應(yīng)用廣泛的分離、分析、純化有機(jī)化合物（包括能通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)化合物的無機(jī)物）的有效方法之一。 在已知的有機(jī)化合物中，約有80%能用高效液相色譜法分離、分析，而且由于此法條件溫和，不破壞樣品，因此特別適合高沸點、難氣化揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物和生命物質(zhì)。

HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、與柱或保護(hù)住、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。

目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters 公司、Agilent 公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有上海伍豐科學(xué)儀器有限公司，上海禾工科學(xué)儀器有限公司，大連依利特公司、北京創(chuàng)新通恒、北京溫分等。

一、輸液泵

1.泵的構(gòu)造和性能輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：

①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)小于0.5%，這關(guān)系到定性定量的準(zhǔn)確性；

②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1～10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；

③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150～300KG/CM2：

④液缸容積小；

⑤密封性能好，耐腐蝕。

泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔往復(fù)泵。恒壓泵受柱陰影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵己被淘汰目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。

柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱壓影響；泵壓可達(dá)400KG/CM2.ADW主要缺點是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多彩采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2～0.3%），但出現(xiàn)故障的機(jī)會較多（因多了單向閥），價格也較貴。

二、進(jìn)樣器

一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊子（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。耐高壓（35～40MPA），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。六通閥進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75%），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5～10倍9最少3倍，這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)和流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。

三、色譜柱

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10UM等，柱效理論值可達(dá)5～16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難的分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10～30CM左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，不要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

四、檢測器

HPLC的檢測器分為兩類：通用型檢測器和專用型檢測器。

1.通用型檢測器可連續(xù)測量色譜柱的流出物的全部特性變化，通常采用差分測量法，這類檢測器包括示差折光檢測器、介電常數(shù)檢測器、電導(dǎo)檢測器等，通用檢測器適用范圍廣，但由于對流動相有響應(yīng)，因此易受溫度變化、流動相和組分的變化的影響，噪聲和漂移都比較大，靈敏度較低，不能用梯度洗脫。

2.專用型檢測器用以測量被分離樣品組分某種特性的變化。這類檢測器對樣品中組分的某種物理或化學(xué)性質(zhì)敏感，而這一性質(zhì)是流動相所不具備的，或至少在操作條件下不顯示。這類檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器、放射性檢測器等。