【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?

1. 學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue ，CBB）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。

2. 學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

考馬斯亮藍(lán)G-250存在兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer?蒺s law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式變?yōu)樗{(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后蛋白質(zhì)和染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)和染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，在測(cè)定溶液中含蛋白質(zhì)5μg/mL時(shí)就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測(cè)定范圍為10～100μg蛋白質(zhì)，微量測(cè)定法測(cè)定范圍是1～10μg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好，精確度高，線性關(guān)系好。此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無(wú)干擾。強(qiáng)堿緩沖液在測(cè)定中有一些顏色干擾，這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照扣除其影響。

考馬斯亮藍(lán)(CBB) 法由于方法簡(jiǎn)單, 顯色劑單一, 反應(yīng)迅速等更被常用。但對(duì)于大批量而蛋白質(zhì)含量又少的樣品測(cè)定, 常量法 (MC) 測(cè)定比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)試劑, 且CBB與蛋白質(zhì)結(jié)合物易吸附在比色杯上, 不易清洗, 重復(fù)使用會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。因此, 我們建立了考馬斯亮藍(lán)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀微盤比色測(cè)定法(MPC)。

【實(shí)驗(yàn)試劑與器材】

1. 儀器 試管，試管架，移液管（0.1ml及5ml），移液器(10μl可調(diào), 200μl可調(diào))，玻璃均漿器，眼科剪，鑷子，天平，分光光度計(jì)，96孔板，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

2. 試劑及其配制

（1）考馬斯亮藍(lán)試劑 考馬斯亮藍(lán)G 250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，用濾紙過(guò)濾避光保存?zhèn)溆谩?

（2）標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)溶液 蛋白濃度為0.5g／l, 以生理鹽水配制。

（3）生理鹽水。

【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】

1. 樣品制備 頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取小鼠肝組織,用生理鹽水制成5g／L的勻漿。如有塊狀不溶物，會(huì)造成加樣誤差，應(yīng)先以500 rpm離心5min，取上清液備用。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

常量法:

在試管中分別加入BSA標(biāo)準(zhǔn)液: 12. 5， 25， 50， 75， 100， 125， 150 μl (即含BSA分別為6. 25， 12. 5， 25， 37. 5， 50， 62. 5， 75μg) ， 然后分別加生理鹽水補(bǔ)充使其體積為200μl，空白管加200μL 生理鹽水， 混勻后各加考馬斯亮藍(lán)顯色液4000μl，搖勻， 室溫放置5 min 后， 在595 nm比色測(cè)光密度。

微量法:

在96 孔板中分別加入BSA 標(biāo)準(zhǔn)液1. 25， 2. 50， 3. 75， 5. 00， 6. 25， 7. 50 μL (含BSA 分別為0. 625， 1. 250， 1. 875， 2. 500， 3. 125， 3. 750 μg)，再用生理鹽水補(bǔ)充使每孔液體體積為10 μl， 空白孔只加生理鹽水10 μl， 慢慢搖勻后，分別各加CBB 顯色液200μl搖勻， 室溫放置5 m in 后， 在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀600 nm 直接測(cè)定吸光度。將各自測(cè)定的結(jié)果在作直線回歸，并作圖。

3. 樣品蛋白含量測(cè)定

測(cè)定方法同上，取合適體積的未知樣品液，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)分別所測(cè)定的A595nm，600 nm值，從回歸方程計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

4. 從測(cè)定結(jié)果計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)濃度,并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法說(shuō)明兩種測(cè)定方法的相關(guān)性。

【注意事項(xiàng)】

1. Tris，乙酸，2－巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X-100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對(duì)顏色影響太大而不易消除。

2. 如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5～20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。

3. 測(cè)定中，蛋白－染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，對(duì)測(cè)定結(jié)果會(huì)有一定的影響,所以常量法每測(cè)定完一樣品后要用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。

4. 如有全波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,測(cè)定波長(zhǎng)就選600nm。

思 考 題

1. 考馬斯亮藍(lán)微盤比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理是什么?

2. 如何避免測(cè)定誤差?

3. 試比較兩種測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)。