【摘要】  探討蟾毒靈對裸鼠人肝癌原位移植模型的抗腫瘤作用及對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響。方法：建立裸鼠人肝癌原位移植模型，隨機分為蟾毒靈高（1.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、低（0.5 mg/kg）劑量治療組，阿霉素8 mg/kg治療組和模型組。裸鼠人肝癌原位移植模型第25天測量腫瘤體積，取瘤組織做HE染色觀察腫瘤壞死程度并行電鏡觀察，DNA原位末端標記法檢測凋亡標記指數(shù)，免疫組化法檢測肝癌組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達。結(jié)果：蟾毒靈各劑量組腫瘤體積均較模型組明顯縮?。?P <0.01），生存期較阿霉素治療組及模型組延長 （ P < 0.05）。電鏡觀察到蟾毒靈各組腫瘤出現(xiàn)明顯的細胞凋亡征象，低、中、高劑量治療組的凋亡指數(shù)分別為5.87±2.13、8.86±2.96和10.60±3.42，明顯高于阿霉素治療組的3.28±0.98（ P <0.05或 P < 0.01）； 蟾毒靈各組瘤組織的Bax表達明顯增強，而Bcl-2表達無明顯改變。結(jié)論：蟾毒靈對裸鼠人肝癌原位移植模型有明顯的抗腫瘤作用，其作用機制可能與上調(diào)Bax表達、誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  蟾毒靈；肝癌；細胞凋亡；Bcl-2；Bax；裸小鼠

　　蟾毒靈（bufalin）是從中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一，分子式為C24H32O4，相對分子質(zhì)量為386.5.研究表明，蟾毒靈具有誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡的作用，主要涉及到白血病、前列腺癌、胃癌、肝癌等人類腫瘤，且僅限于體外研究［1～4］。本文旨在探討蟾毒靈對人肝癌裸鼠原位移植模型的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)及對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響。

　　1 材料和方法

　　1.1 實驗材料

　　1.1.1 實驗動物和瘤株 BALB/C-nu/nu裸鼠，由復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心提供，SCKK（滬）2003-0003，4～5周齡，體質(zhì)量18～20 g，雄性，在無特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng)。人肝癌細胞株BEL-7402，由中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所提供，由第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院中醫(yī)科實驗室傳代凍存。

　　1.1.2 藥物和試劑 蟾毒靈，美國Sigma公司產(chǎn)品；阿霉素（adriamycin， ADM），深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；DNA原位末端標記試劑盒，Boehringer Mannhein公司產(chǎn)品；鼠抗人Bcl-2和Bax蛋白單克隆抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 模型分組及處理 參照文獻制作裸鼠人肝癌原位移植模型［5，6］，隨機分為蟾毒靈1.5、1.0和0.5 mg/kg治療組，ADM治療組和模型組，每組 15只。 各組均于造模后第15天用藥，蟾毒靈治療組分別腹腔注射，第15～24天，1次/d；模型組注射等體積的生理鹽水（normal saline， NS），方法同蟾毒靈組；ADM按8 mg/kg腹腔注射，僅在造模第 15天 給藥1次。停藥次日每組處死荷瘤鼠10只，用游標卡尺分別測量瘤體的長徑（a）和短徑（b），依據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積；抑瘤率（%）=［1-（V治療組/V模型組）］×100.每組剩余小鼠（5只）觀察生存期，計算生命延長率。生命延長率（%）=［（藥物組平均存活天數(shù)-NS組平均存活天數(shù)）/NS組平均存活天數(shù)］×100.

　　1.2.2 組織學(xué)及電鏡觀察 部分瘤組織用10%福爾馬林固定，石蠟切片，HE染色作常規(guī)病理檢查，觀察腫瘤組織壞死程度［7］。剩余瘤組織以3%戊二 醛固定1～3 h，緩沖液沖洗后，用1%四氧化鋨固定1～2 h，梯度丙酮脫水和Epon 812包埋，醋酸雙氧鈾與檸檬鉛雙染色、切片，電子染色，透射電鏡下觀察拍照。

　　1.2.3 DNA原位末端標記檢測 采用TdT介導(dǎo)的帶生物素dUTP缺口末端標記技術(shù)（terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL）檢測細胞凋亡指數(shù)［7］。以PBS代替TUNEL反應(yīng)液作為陰性對照，以細胞核有明顯棕黃色為陽性細胞。每張切片觀察10個高倍視野，陽性記數(shù)采用雙盲法，計數(shù)時避開腫瘤壞死區(qū)，每100個細胞中的陽性細胞數(shù)為標記指數(shù)（label index， LI）。

　　1.2.4 Bcl-2和Bax蛋白的免疫組化檢測 采用過氧化酶標記的鏈霉卵白素（streptavidin peroxidase， SP）法，DBA顯色，按照試劑說明書的流程進行檢測。在光鏡下觀察，以胞漿內(nèi)棕黃色細顆粒為Bcl-2和Bax陽性染色，細胞計數(shù)方法同TUNEL檢測。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用 x ±s 表示，進行單因素方差分析。

　　2 結(jié)果

　　2.1 荷瘤裸鼠體質(zhì)量及腫瘤變化 治療前各組腫瘤大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05），提示各組瘤體大小具有可比性。與模型組相比，裸鼠人肝癌原位移植模型經(jīng)蟾毒靈和ADM治療后瘤體均明顯縮?。?P <0.01），蟾毒靈高劑量治療組的抑瘤率高于ADM治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）；蟾毒靈治療前后各組裸鼠的體質(zhì)量無明顯改變（ P > 0.05）。 見表1.

　　2.2 平均生存期及生命延長率 蟾毒靈治療后各組裸鼠的平均生存期均有所延長，蟾毒靈高、中、低劑量治療組生命延長率分別為35.9%、29.9%和17.1%，蟾毒靈各組與模型組生存時間相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05），以蟾毒靈高劑量治療組最為明顯，而ADM治療組裸鼠生存期未見延長。見圖1.

　　2.3 肝腫瘤壞死程度 治療后，模型組瘤組織呈輕度壞死，蟾毒靈高、中劑量治療組和ADM治療組癌灶內(nèi)有大量纖維結(jié)締組織增生，肝癌組織以中重度壞死為主。但壞死灶主要集中在腫瘤中央部位，肝癌細胞在癌灶邊緣生長仍較為活躍。見圖2.

　　2.4 肝癌細胞的超微結(jié)構(gòu) 模型組癌細胞表面不規(guī)則，核大呈圓形，染色質(zhì)增多，游離核糖體較多，胞質(zhì)內(nèi)可見較豐富的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。蟾毒靈各治療組?？梢娂毎斯炭s的肝癌細胞，胞漿濃縮，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)側(cè)呈團塊或新月狀，胞漿起泡和凋亡小體，并見凋亡小體脫離細胞體，沒入間質(zhì)或被其他 細胞吞飲。

　　2.5 瘤組織凋亡標記指數(shù)及Bcl-2和Bax蛋白的表達 蟾毒靈治療組肝癌細胞的凋亡指數(shù)分別明顯高于模型組，ADM治療組凋亡指數(shù)未見明顯增加。蟾毒靈治療組Bcl-2蛋白陽性表達率均有所降低，表達強度較弱，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；瘤組織均見Bax蛋白高表達，Bax蛋白表達標記指數(shù)隨著蟾毒靈劑量的增加而提高。見表2、圖3.

　　表1 裸鼠人肝癌原位移植模型蟾毒靈治療前后體質(zhì)量及瘤體變化（略）

　　Table 1 Changes of mouse body weight and tumor volume of human hepatocellular orthotopically transplanted tumor induced by bufalin

　　*P <0.05， vs ADM-treated group；△△P <0.01， vs NS-treated group.

　　圖1 各組平均生存時間（略）

　　Figure 1 Mean survival time of five groupsBu1： High-dose bufalin-treated group； Bu2： Medium-dose bufalin-treated group； Bu3： Low-dose bufalin-treated group；*P <0.05， vs NS-treated group； n =5.

　　圖2 瘤組織壞死程度的病理形態(tài)（HE染色， ×250）（略）

　　Figure 2 Pathological characteristics of tumor necrosis （HE staining， ×250）A： NS-treated group； B： High-dose bufalin-treated group.

　　表2 肝癌組織細胞凋亡及Bcl-2、Bax表達的標記指數(shù)（略）

　　Table 2 Label index of tumor cell apoptosis and expressions of Bcl-2 and Bax in tumor tissues

　　*P <0.05，**P <0.01， vs NS-treated group.

　　圖3 裸鼠原位肝內(nèi)移植瘤Bax蛋白的表達（SP法， ×200）（略）

　　Figure 3 Expression of Bax in orthotopically transplanted tumor of human hepatocellular carcinoma in nude mice （SP method， ×200）

　　A： Bax expressed weakly in NS-treated group. B： High expression in high-dose bufalin-treated group.

　　3 討論

　　蟾酥及其相關(guān)制劑一直是臨床治療肝癌最有效的中藥之一［8］。蟾酥的化學(xué)成分復(fù)雜，通過對蟾酥的分離和鑒定，主要的化學(xué)成分已得到部分確認［9，10］。蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的毒性配基之一，屬于細胞拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑。蟾毒靈對血液腫瘤、前列腺癌、胃癌等人類腫瘤的抑制作用已有報道，但未見有對人肝癌細胞的體內(nèi)研究報道。在對蟾毒靈抗腫瘤的前期研究中發(fā)現(xiàn)蟾毒靈在體外對人肝癌SMMC-7721和BEL-7402細胞株具有較強的殺傷作用，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡及細胞周期G2/M期阻滯，這可能是蟾毒靈抗肝癌的作用機制［4，11］，但蟾毒靈在體內(nèi)抗人肝癌的作用仍不清楚。蟾毒靈對小鼠的LD50為2.2 mg/kg［12］，本實驗預(yù)實驗也發(fā)現(xiàn)2 mg/kg的一次性給藥劑量就可使小鼠發(fā)生一過性的痙攣性抽搐，但未引起小鼠中毒性死亡。鑒于此，本實驗主要研究給予1.5 mg/kg及以下劑量蟾毒靈時動物體內(nèi)的抗腫瘤作用。人類腫瘤裸鼠原位移植瘤模型是抗癌藥物篩選和機制研究較為理想的動物模型，我們成功建立了裸鼠人肝癌原位移植模型，在此基礎(chǔ)上觀察蟾毒靈對裸鼠原位人肝癌移植模型的抗腫瘤效果，結(jié)果表明蟾毒靈按總量15、10和5 mg/kg分10 d連續(xù)給藥治療裸鼠原位人肝癌移植性模型在瘤體縮小方面具有與阿霉素8 mg/kg相同的療效，且在帶瘤生存期的延長及模型生活質(zhì)量（體質(zhì)量的增減）的改善方面，蟾毒靈各治療組明顯優(yōu)越于阿霉素治療組。提示蟾毒靈在體內(nèi)具有良好的抗肝癌作用。病理學(xué)及TUNEL檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、中劑量蟾毒靈不僅能導(dǎo)致肝癌組織中、重度壞死及大量纖維結(jié)締組織增生，而且能原位誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，凋亡標記指數(shù)與蟾毒靈給藥呈劑量依賴性。細胞凋亡是由于細胞內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起的細胞主動死亡的過程。Bcl-2基因家族是細胞凋亡研究中最受重視的基因，目前已發(fā)現(xiàn)幾個與Bcl-2同源的基因，包括Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bak、mcl-1、A1、Bag-1、Bfl-1、ced9、BHRF-1等，構(gòu)成了Bcl-2家族。其中Bax基因是Bcl-2家族中的一員，其生物學(xué)作用是拮抗Bcl-2，與Bcl-2形成二聚體，抑制或促進細胞凋亡。Bcl-2和Bax的比例決定細胞的凋亡狀態(tài)：Bcl-2表達水平高于Bax時，Bcl-2和Bcl-2形成同源二聚體，細胞凋亡受抑制；Bax表達水平高于Bcl-2時，則形成Bax-Bax同源二聚體，細胞凋亡增強［13］。有資料顯示，Bcl-2蛋白在肝癌組織和肝癌細胞系中，一般只呈低水平的表達 或不表達，而Bax蛋白則呈較高水平的表達［14］。本研究中裸鼠人肝癌原位移植瘤的免疫組化結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白陽性表達率僅為9.05%，而Bax蛋白陽性表達率為31.25%，這與文獻報道一致。蟾毒靈治療后均未見瘤組織Bcl-2表達率的明顯變化，而Bax表達卻明顯提高，瘤組織Bax蛋白陽性標記指數(shù)與凋亡標記指數(shù)有正相關(guān)趨勢（ r =0.876 8），提示上調(diào)Bax蛋白表達、誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡可能是蟾毒靈體內(nèi)抗肝癌的機制之一。

　　【參考文獻】

　　1Yamado K， Hino K， Tomoyasu S. et al. Enhancement by bufalin of retinoic acid-induced differentiation of acute promyelocytic leukemia cells in primary culture. Leuk Res. 1998； 22（7）： 589-595.

　　2 Yeh JY， Huang WJ， Kan SF， et al. Effects of bufalin and cinobufagin on the proliferation of androgen depend-ent and independent prostate cancer cells. Prostate. 2003； 54（2）： 112-124.

　　3 Chen XY， Xu RC， Chen L， et al. Apoptosis of gastric cancer cells induced by bufalin. Ji Chu Yi Xue Yu Lin Chuang. 2000； 20（5）： 50-53. Chinese with abstract in English.陳小義， 徐瑞成， 陳莉， 等。 蟾蜍靈誘導(dǎo)人胃癌細胞凋亡的實驗研究。 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床。 2000； 20（5）： 50-53.

　　4 Gu W， Han KQ， Su YH， et al. Effect of bufalin on proliferation of BEL-7402 human hepatocarcinoma cell line. Zhong Xi Yi Jie He Gan Bing Za Zhi. 2006； 16（1）： 16-17， 20. Chinese with abstract in English.顧偉， 韓克起， 蘇永華， 等。 蟾毒靈對人肝癌BEL-7402細胞增殖的影響。 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志。 2006； 16（1）： 16-17， 20.

　　5 Gu W， Shen J， Zhai XF. Preliminary study on biologi-cal behavior and staging of transplanted hepatoma in rats. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2005， 3（2）： 136-138. Chinese with abstract in English.顧偉， 沈婕， 翟笑楓。 大鼠移植性肝癌模型生物學(xué)行為與分期的初步探討。 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報， 2005， 3 （2）： 136-138.

　　6 Han KQ， Gu W， Zhang YN， et al. Establishment of orthotopic transplantation tumor models of human hepa-tocellular carcinoma in nude mice. Di Si Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2004. 25（17）： inside front cover. Chinese.韓克起， 顧偉， 張亞妮， 等。 裸鼠人肝癌原位移植模型的建立。 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報。 2004； 25（17）： 封2.

　　7 Li Q， Fan ZZ， Li XQ， et al. Effects of interventional therapy with norcantharidin microsphere on hepatoma in rats and its mechanism. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2006； 4（4）： 378-383. Chinese with abstract in English.李琦， 范忠澤， 李先茜， 等。 去甲斑蝥素微球介入治療大鼠肝癌療效及其機制研究。 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報。 2006； 4（4）： 378-383.

　　8 Chen Z， Zhai XF， Su YH， et al. Clinical observation of cinobufacini injection used to treat moderate and ad-vanced primary liver cancer. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2003； 1（3）： 184-186. Chinese with abstract in English.陳 ， 翟笑楓， 蘇永華， 等。 華蟾素注射液治療中晚期原發(fā)性肝癌臨床療效觀察。 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報。 2003； 1（3）： 184-186.

　　9 Kamano Y， Nogawa T， Yamashita A， et al. Isolation and structure of a 20， 21-epoxybufenolide series from “Ch‘a(chǎn)n Su”。 J Nat Prod. 2002； 65 （7）： 1001-1005.

　　10 Su YH， Niu X. Pharmacodynamic research of “Ch‘a(chǎn)n Su” praeparatum： a review. Beijing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 2001； 24（2）： 51-54. Chinese.蘇永華， 牛欣。 蟾酥制劑的藥效作用研究評述。 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報。 2001； 24（2）： 51-54.

　　11 Su YH， Yin XC， Xie JM， et al. Inhibition effects of three kinds of bufotoxins on human SMMC-7721 andBEL-7402 hepatoma cell lines. Di Er Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2003； 24（4）： 393-395. Chinese with abstract in English.蘇永華， 尹西才， 謝覺民， 等。 三種蟾毒單體對SMMC-7721和BEL-7402人肝癌細胞生長的抑制作用。 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報。 2003； 24（4）： 393-395.

　　12 Jiangsu New Medical College. Dictionary of Chinese Traditional Drugs. Shanghai： Shanghai Scientific and Technical Publishers. 1977： 84-85. Chinese.江蘇新醫(yī)學(xué)院。 中藥大辭典。 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社。 1977： 84-85.

　　13 Cory S， Adams JM. Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch. Cancer Cell. 2005； 8（1）： 5-6.

　　14 Terada T， Nakanuma Y. Expression of apoptosis， pro-liferating cell nuclear antigen， and apoptosis-related an-tigen （bcl-2， c-myc， Fas， Lewis（y） and p53） in human cholangiocarcinomas and hepatocellular carcinomas. Pathol Int. 1996； 46（10）： 764-770.