【關(guān)鍵詞】  恐懼應(yīng)激；激素類；學(xué)習(xí)；記憶；大鼠

　　Effects  of acute fear stress on hormone levels， abilities of spatial learning  and  memory  of  rats

　　CHEN YaoMing， ZHENG Gang， ZHANG XuePing，   LUO WenJing， ZHANG Yun， CHEN JingYuan

　　Department of Occupational and Environmental Hygiene， School of Military Preventive Medicine， Fourth Military Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】  AIM：  To  study  the effects of acute fear stress on the hormone levels， and the abilities of spatial learning and memory of rats. METHODS：  Thirtytwo adult male SD rats weighing 180-220 g were randomly divided  into control group （n=16） and stress group （n=16）。 Rats of stress group received 30min  acute stress including white noise， and foot shock， and then the spatial learning and memory performance was measured by Morris water maze. The hormone levels in plasma and brain were determined by spectrophotofluorometry and radioimmunoassay   kit. RESULTS：  In water maze task， the time taken for fearstressed rats to find the platform （latency） for spatial bias was prolonged（P<0.05）， and the frequency of crossing over the platform location was decreased in the probe trail （P<0.01）。 The stress also resulted in significantly higher plasmic and cerebral noradrenaline， corticosteroid， 5hydroxytryptamine levels， and lower adrenomedulin level in comparison with the controls （P<0.01）。 CONCLUSION：  Acute fear stress leads to abnormalities of learning and memory of rats， and the alteration of hormone levels in this process may be a significant mechanism underlying the effect.

　　【Keywords】   fear stress；  hormones；   learning； memory；  rats

　　【摘要】  目的：觀察急性應(yīng)激對(duì)大鼠激素水平、空間學(xué)習(xí)記憶行為的影響，探討恐懼應(yīng)激對(duì)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制。 方法： 成年雄性SpragueDawley大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g. 隨機(jī)分成對(duì)照組（n=16）和應(yīng)激組（n=16）。 用足電擊+白噪聲刺激方式建立急性恐懼應(yīng)激大鼠模型，并進(jìn)行空間覓向能力測(cè)試，以判斷動(dòng)物記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)能力。 放射免疫法及熒光分光光度法檢測(cè)血漿和腦組織激素水平。 結(jié)果： 血漿及腦組織去甲腎上腺素、5羥色胺、皮質(zhì)醇水平增高，而腎上腺髓質(zhì)素水平降低（P<0.01）；水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示急性恐懼應(yīng)激后大鼠訓(xùn)練潛伏期（LP）與對(duì)照組相比延長(zhǎng)（P<0.05），在限定時(shí)間內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)原位置的次數(shù)顯著減少（P<0.01）。 結(jié)論： 急性恐懼應(yīng)激可以顯著影響大鼠的激素水平，對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力造成損傷。

　　【關(guān)鍵詞】  恐懼應(yīng)激；激素類；學(xué)習(xí)；記憶；大鼠

　　0引言

　　研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人或動(dòng)物處于強(qiáng)烈的急性應(yīng)激或長(zhǎng)期慢性應(yīng)激的狀況時(shí)，其學(xué)習(xí)記憶能力可受到明顯的影響。 如今，應(yīng)激對(duì)腦功能，尤其對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響引起了人們極大的關(guān)注，成為神經(jīng)科學(xué)和心理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 為研究急性恐懼應(yīng)激對(duì)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的影響，本實(shí)驗(yàn)在建立急性恐懼應(yīng)激大鼠模型的基礎(chǔ)上，分別觀察應(yīng)激后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為和激素水平的變化，探討恐懼應(yīng)激對(duì)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制。

　　1材料和方法

　　1.1材料成年雄性SpragueDawley大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 首先將大鼠在動(dòng)物飼養(yǎng)室中適應(yīng)1 wk，室溫23±1℃，自然光照，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食水。 將動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組（n=16）和應(yīng)激組（n=16）。

　　1.2方法將大鼠放入電擊籠（40 cm×30 cm×20 cm）中，由電刺激發(fā)生裝置（由第四軍醫(yī)大學(xué)物理學(xué)教研室提供）輸出為48 V，持續(xù)1 s，間隔5 s，電流經(jīng)籠底金屬柵刺激大鼠足底，刺激時(shí)間為30 min. 同時(shí)由DF1681型噪聲信號(hào)發(fā)生器經(jīng)揚(yáng)聲器輸出95 dB，20 Hz20 kHz的白噪聲作用于大鼠。 對(duì)照組不受應(yīng)激原影響。 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的觀察，采用morris水迷宮法。 第1～4日為空間定向條件反射訓(xùn)練（spatial bias）。 4次/d，每次2 min，記錄大鼠從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺(tái)的時(shí)間為訓(xùn)練潛伏期，每3次的均值作為1個(gè)觀察單位，比較所得的各觀察單位訓(xùn)練潛伏期變化以分析動(dòng)物獲取空間信息的能力；第5日應(yīng)激組大鼠首先接受30 min的足電擊+噪聲刺激，然后重復(fù)測(cè)試潛伏期（latency period），并進(jìn)行空間覓向能力測(cè)試（probe trial），即先將平臺(tái)移去，再將動(dòng)物放入水中2 min，記錄它穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)（以平臺(tái)2倍直徑計(jì)算），以判斷動(dòng)物記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)能力。 應(yīng)激后，8只大鼠分別于0 min和30 min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死大鼠，取血，并迅速在冰上分離全腦組織，分別檢測(cè)血漿中和腦組織中的激素水平：去甲腎上腺素（NE）和5羥色胺（5HT）水平檢測(cè)采用熒光分光光度法［1］；樣品測(cè)定：腦組織加10倍腦體積量冷酸性正丁醇在玻璃試管中，置于冰水浴中，內(nèi)切式勻漿機(jī)勻漿，勻漿液用2000 r/min離心5 min，取上清液2.5 mL置于內(nèi)含0.1 mol/L HCL 1.0 mL和正庚烷5.0 mL的具塞離心管中，充分振蕩5 min，2500 r/min離心5 min，從下面水相中分別取0.5 mL和0.4 mL. 前者用于測(cè)定NA，后者用于測(cè)定5HT. NA測(cè)定：于0.5 mL上述水相提取液中，加入1/15 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液1.5 mL和EDTA試劑0.4 mL，混合；加入堿性亞硫酸鈉溶液0.4 mL混合，3 min后，加入5 mol/L冰醋酸0.4 mL，混合，具塞避光置于80℃水浴5 min，取出迅速冷卻后立即在380/490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行NA熒光強(qiáng)度測(cè)定。 5HT測(cè)定：取水相提取液0.4 mL，加2.5 g/L半光氨酸0.1 mL. 混合后加0.01 g/L OPT和8 mol  HCL混合液3 mL，混合后置于沸水浴中10 min，取出后立即冷卻，用360/480 nm波長(zhǎng)進(jìn)行5HT熒光強(qiáng)度測(cè)定。 同時(shí)作空白管測(cè)定，將各樣品剩余之水相提取液混合，取其中0.4 mL，加8 mol/L HCL 3.0 mL置于沸水浴中10 min，加1 g/L OPT和8 mol HCL混合液30 μL和2.5 g/L半光氨酸0.1 mL，然后在360/480 nm波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度。 腎上腺皮質(zhì)醇（CORT）、腎上腺髓質(zhì)素（ADM）水平的檢測(cè)按照放射免疫分析試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法為方差分析以及Dunnettt檢驗(yàn)。

　　2結(jié)果

　　2.1行為學(xué)觀察水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示急性恐懼應(yīng)激后大鼠訓(xùn)練潛伏期（LP）與對(duì)照組相比延長(zhǎng)（P<0.05），在限定時(shí)間內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)原位置的次數(shù)顯著減少（P<0.01，表1）。

　　表1急性恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（略）

　　aP<0.05， bP<0.01 vs對(duì)照。

　　2.2激素水平改變大鼠應(yīng)激后即刻與30 min時(shí)血漿NE、CORT水平均顯著增高，5HT 即刻水平降低，30 min時(shí)升高，且顯著高于對(duì)照組水平，ADM水平在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P<0.01，表2）。 腦組織中NE和5HT（僅30 min時(shí)，P<0.05）水平比對(duì)照組顯著增高（P<0.01，表2）。

　　表2急性恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠激素水平的影響（略）

　　aP<0.05， bP<0.01 vs對(duì)照。

　　3討論

　　應(yīng)激的主要非特異性反應(yīng)之一是下丘腦垂體腎上腺（HPA）軸的激活，引起兒茶酚胺能神經(jīng)元興奮，去甲腎上腺素、腎上腺素、腎上腺糖皮質(zhì)激素（GC）等分泌增多。 從而引起全身性代謝效應(yīng)、生理變化（尤其是腦功能變化）乃至行為改變和疾病發(fā)生。 病理應(yīng)激危害的主要原因之一，是由較高水平的激素作用造成的。 高濃度的激素不但危害機(jī)體的免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等，而且可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)也造成危害。 在心理應(yīng)激狀態(tài)下，CORT， NE的濃度呈上升趨勢(shì)［2］，一方面可以幫助機(jī)體緩沖和適應(yīng)應(yīng)激刺激，但另一方面也是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生應(yīng)激疾病的重要因素。 認(rèn)知功能與糖皮質(zhì)激素的關(guān)系呈倒U型，損傷效應(yīng)與糖皮質(zhì)激素的不足和過(guò)多有關(guān)［3］。 正常水平的糖皮質(zhì)激素參與學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程，低水平的糖皮質(zhì)激素活化糖皮質(zhì)激素受體（GR）不夠，使得GR核轉(zhuǎn)位的數(shù)量減少，GR與激素反應(yīng)元件的結(jié)合數(shù)減少，影響GR基因組效應(yīng)的發(fā)揮。 高水平的糖皮質(zhì)激素過(guò)度活化GR損傷學(xué)習(xí)記憶過(guò)程［4-5］。 另外，應(yīng)激時(shí)動(dòng)物腦內(nèi)可出現(xiàn)5HT更新加速的現(xiàn)象，同時(shí)5HT還被認(rèn)為是參與應(yīng)激性焦慮的重要遞質(zhì)。 ADM在內(nèi)分泌系統(tǒng)中有著明顯的調(diào)節(jié)作用，可影響人和大鼠腎上腺皮質(zhì)的分泌活性。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)激后，大鼠血漿CORT， NE水平在0 min和30 min時(shí)均顯著增高；5HT即刻水平降低，而30 min時(shí)水平增高，且顯著高于對(duì)照組水平；ADM水平在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低。 全腦組織中NE水平在0 min和30 min時(shí)均顯著增高；而5HT水平在30 min時(shí)也比對(duì)照組顯著增高。 上述結(jié)果提示急性恐懼應(yīng)激可以顯著影響機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，并可能進(jìn)一步對(duì)大腦功能和情感行為產(chǎn)生影響。

　　突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation， LTP）是衡量神經(jīng)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)［6-7］，應(yīng)激可以使LTP產(chǎn)生受到抑制，改變神經(jīng)突觸可塑性，從而造成學(xué)習(xí)記憶能力的下降。 LTP的抑制與腦內(nèi)過(guò)高的GC有一定的因果關(guān)系，激活糖皮質(zhì)激素受體（GR）則抑制LTP. 應(yīng)激或大量補(bǔ)充GC還可以增大谷氨酸（Glu）對(duì)海馬的損傷程度。 過(guò)量的GC會(huì)同時(shí)抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的能量代謝，使胞內(nèi)ATP缺乏，同時(shí)導(dǎo)致大量Glu在胞外堆積，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性。 另外，應(yīng)激水平GC長(zhǎng)期的作用下，海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生死亡的主要機(jī)制可能是凋亡。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性恐懼應(yīng)激可以造成大鼠血漿GC皮質(zhì)酮， NE， 5HT水平的升高，同時(shí)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，不但妨礙學(xué)習(xí)過(guò)程（記憶的獲得和鞏固），而且影響記憶的重現(xiàn)。 上述結(jié)果提示高水平的激素可能對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力造成損傷。

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