【摘要】  探討急性膽管炎狀態(tài)下細(xì)胞免疫中樞胸腺的變化以及中藥錦紅片的干預(yù)作用。方法：雄性清潔級(jí)SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組8只。膽總管單純結(jié)扎組（簡稱單純結(jié)扎組）：結(jié)扎膽總管，但不注射細(xì)菌，手術(shù)后喂生理鹽水；模型組：建立大鼠急性膽管炎模型，造模手術(shù)后喂生理鹽水；錦紅片治療組：造模手術(shù)后喂錦紅片懸液。手術(shù)后5 d處死大鼠，胸腺取材，做胸腺電鏡和光鏡形態(tài)學(xué)觀察，并檢測(cè)胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、凋亡指數(shù)、胸腺Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)和胸腺Fas基因編碼蛋白的表達(dá)。結(jié)果：形態(tài)學(xué)上凋亡細(xì)胞出現(xiàn)頻率由高到低依次為模型組、錦紅片治療組和單純結(jié)扎組。模型組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均降低，與錦紅片治療組和單純結(jié)扎組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組胸腺凋亡指數(shù)明顯高于錦紅片治療組和單純結(jié)扎組。錦紅片治療組Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)高于模型組，F(xiàn)as基因編碼蛋白表達(dá)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：急性膽管炎時(shí)大鼠胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)降低，胸腺凋亡指數(shù)升高，非生理性凋亡增加。清熱通下中藥錦紅片有一定的抑制這種非生理性凋亡的作用，這種作用可能是通過上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2編碼蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

　　【關(guān)鍵詞】  胸腺；膽管炎；清熱；通下；錦紅片

　　胸腺是機(jī)體的細(xì)胞免疫中樞，未成熟的T淋巴細(xì)胞通過在胸腺內(nèi)的分化、發(fā)育，成熟后釋放入血，以維持外周T淋巴細(xì)胞池的衡定［1］。凋亡是胸腺細(xì)胞維持外周T淋巴細(xì)胞質(zhì)和量的主要方式，其過程受到嚴(yán)格調(diào)控［2］。以往鮮有急性膽管炎與胸腺細(xì)胞凋亡方面的報(bào)道，而我們?cè)谶^去的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，治療急性膽道感染方面療效顯著的清熱通下中藥錦紅片對(duì)膽管炎動(dòng)物外周免疫反應(yīng)有調(diào)控作用［3～5］。為了解中藥錦紅片在治療急性膽管炎中對(duì)細(xì)胞免疫中樞胸腺的影響，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，10周齡，體質(zhì)量160～180 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。LIBROR AEL-160電子天平，日本島津公司產(chǎn)品；AHBT-5B顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；TEM-1200透射電鏡，日本日立公司產(chǎn)品；石臘切片機(jī)，日本Aiwa公司產(chǎn)品；缺口末端標(biāo)記法（Tdt-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling， TUNEL）試劑盒，Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；Bcl-2單克隆抗體（兔抗鼠IgG）和Fas單克隆抗體（兔抗鼠IgG），Gene公司產(chǎn)品；免疫組化試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品；蛋白酶K、DNA酶和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine， DAB），Sigma公司產(chǎn)品。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法 動(dòng)物領(lǐng)來后放入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所3 d以適應(yīng)環(huán)境，造模前禁食8 h，禁水4 h.參照龔建平等［6］的造模方法，將實(shí)驗(yàn)大鼠膽總管結(jié)扎，同時(shí)向膽總管內(nèi)注入致病性大腸桿菌，建立大鼠急性膽道感染模型。

　　1.3 實(shí)驗(yàn)分組 24只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。膽總管單純結(jié)扎組（簡稱單純結(jié)扎組）：結(jié)扎膽總管，但不注射細(xì)菌，手術(shù)后喂以生理鹽水。模型組：造模手術(shù)后喂以生理鹽水。錦紅片治療組：造模手術(shù)后喂錦紅片懸液，由上海中藥制藥一廠提供錦紅片干粉，以蒸餾水配成含干粉110 mg/ml的懸混液，按10 ml/kg體質(zhì)量灌胃，2次/d.于手術(shù)后第 5天 處死大鼠，胸腺取材。

　　1.4 檢測(cè)指標(biāo)

　　1.4.1 胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù) 完整取出胸腺后，電子天平稱取胸腺質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

　　1.4.2 光鏡觀察 胸腺組織以中性福爾馬林固定， 常規(guī)脫水，包埋，切片，脫臘至水，HE染色。

　　1.4.3 電鏡觀察 取約1 mm×2 mm的胸腺組織，用2.5%戊二醛固定，梯度脫水，包埋，超薄切片，醋酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

　　1.4.4 Bcl-2基因編碼蛋白免疫組化 2 μm石臘切片，脫臘至水，3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，用微波熱修復(fù)抗原，PBS浸泡5 min，5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min；傾去血清，滴加1∶200 Bcl-2單抗100 μl，37 ℃孵育60 min或4 ℃過夜；PBS沖洗3次，5 min/次；滴加適當(dāng)比例的生物素標(biāo)記二抗100 μl，37 ℃孵育10～30 min；PBS沖洗 3次， 5 min/次；滴加適當(dāng)比例稀釋的抗生物素辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育10～ 30 min； PBS沖洗3次，5 min/次，加DAB顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，以正常兔血清代替一抗。

　　1.4.5 Fas基因編碼蛋白免疫組化 步驟基本同上，F(xiàn)as單抗工作濃度為1∶150.

　　1.4.6 TUNEL檢測(cè) 按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明操作，即以生物素化脫氧三磷酸尿苷（deoxy-uridine triphosphate， dUTP）標(biāo)記DNA片段鈍端，再用免疫組化法放大標(biāo)記信號(hào)，用DAB顯色，蘇木素襯染。

　　1.4.7 切片分析 對(duì)TUNEL檢測(cè)、Bcl-2及Fas表達(dá)分析，在不告知?jiǎng)游锓纸M信息的前提下，分別送復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院作閱讀分析并出具報(bào)告。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、凋亡指數(shù)等用 x ±s表示，數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。免疫組化數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1各組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù) 模型組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均降低，而錦紅片治療組均升高。見表1.

　　2.2 TUNEL檢測(cè) 高倍鏡下隨機(jī)計(jì)算各組每份標(biāo)本上、下、左、中、右5個(gè)視野的凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)（%）=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100.經(jīng)TUNEL標(biāo)記后，光鏡下凋亡細(xì)胞的核呈深棕色，標(biāo)記陽性細(xì)胞著色多位于細(xì)胞核周邊，核中央反應(yīng)不明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍較完好。見表2、圖1.

　　表1 各組胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)（略）

　　Table 1 The weight and index of thymus in three groups

　　*P <0.05，**P <0.01， vs untreated group.

　　表2 各組胸腺凋亡指數(shù)（略）

　　Table 2 The index of apoptosis of thymus in three groups

　　*P <0.05，**P <0.01， vs untreated group.

　　2.3 Bcl-2和Fas表達(dá)分析 Bcl-2陽性細(xì)胞著色多位于胞漿及胞膜。錦紅片治療組胸腺Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.01 ）。Fas陽性細(xì)胞著色多位于胞漿、胞膜，部分位于胞膜外。根據(jù)細(xì)胞有無著色、著色深淺及 著色細(xì)胞的比例擬定半定量評(píng)分。A項(xiàng)按顯色有無及顯色深淺計(jì)分：0分為不著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；B項(xiàng)按顯色細(xì)胞的比例評(píng)分：1分為1%～10%，2分為11%～30%，3分為31%～50%，4分為51%以上。每例總積分=A×B，總積分0分為（ ），1～3分為（+），3～6分為（++），6分以上為（+++）。各組Bcl-2和Fas表達(dá)均檢測(cè)8份標(biāo)本，每張切片高倍鏡下隨機(jī)取上、下、左、中、右5個(gè)視野計(jì)數(shù)。結(jié)果見表3.

　　2.4 光鏡觀察 模型組胸腺皮質(zhì)變薄，有少量炎性細(xì)胞浸潤，胸腺細(xì)胞密度降低，有少量點(diǎn)狀壞死灶；錦紅片治療組胸腺皮質(zhì)較模型組厚，同單純結(jié)扎組基本相同，有少量炎性細(xì)胞浸潤，胸腺細(xì)胞數(shù)較模型組多，未見明顯壞死灶。

　　2.5 電鏡觀察 各組胸腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本相同，模型組胸腺中有較多巨噬細(xì)胞，可見大量典型的凋亡細(xì)胞，特征為染色質(zhì)濃縮、邊聚、核膜皺縮，微絨毛消失，凋亡小體形成，部分呈新月形，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器存在，可見凋亡小體被鄰近細(xì)胞及巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。與TUNEL檢測(cè)到的胸腺凋亡指數(shù)結(jié)果相似，電鏡觀察到胸腺中的凋亡細(xì)胞比例以模型組最高，錦紅片治療組次之，單純結(jié)扎組最低。見圖2.

　　圖1 各組胸腺組織TUNEL陽性（×400）（略）

　　Figure 1 TUNEL positive thymus in three groups （×400）

　　A： Ligation group； B： Untreated group； C： Jinhong Tablet-treated group.

　　圖2 各組透射電鏡下胸腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×5 000）（略）

　　Figure 2 The structure of thymocyte in three groups under electron transmission microscopy （×5 000）

　　A： Ligation group； B： Untreated group； C： Jinhong Tablet-treated group

　　表3 胸腺Bcl-2和Fas基因編碼蛋白表達(dá)（略）

　　Table 3 Expressions of Bcl-2 and Fas gene coding proteins

　　3 討論

　　胸腺是T淋巴細(xì)胞成熟的場(chǎng)所，胸腺細(xì)胞成熟過程中，某些細(xì)胞克隆的清除、選擇，都涉及到凋亡機(jī)制，識(shí)別自身抗原的自身反應(yīng)T淋巴細(xì)胞在胸腺發(fā)育成熟后，甚至在發(fā)育過程中就經(jīng)凋亡途徑被清除。細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)觀察表明，胸腺是一個(gè)大量產(chǎn)生短命細(xì)胞的場(chǎng)所，大多數(shù)胸腺淋巴細(xì)胞未發(fā)育成熟即已凋亡［7，8］。脂多糖靜脈注射能引起胸腺細(xì)胞凋亡，并且伴有血漿腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量升高，而抗TNF-α抗體可抑制引起的胸腺細(xì)胞DNA的片段化；IL-1、IL-2可分別抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的未成熟胸腺細(xì)胞的凋亡和糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的凋亡［9～11］。細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)，根據(jù)作用的不同，可將與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因分為凋亡促進(jìn)基因（稱自殺基因）和凋亡抑制基因（或稱生存基因）。Bcl-2是公認(rèn)的生存基因，F(xiàn)as則屬于自殺基因。凋亡活動(dòng)是若干相關(guān)基因共同作用完成的，不可能是單一基因表達(dá)的結(jié)果［12，13］。通過凋亡過程死亡的胸腺皮質(zhì)細(xì)胞絕大多數(shù)不能表達(dá)Bcl-2，Bcl-2表達(dá)參與T細(xì)胞的保留；Fas與胸腺細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，F(xiàn)as系統(tǒng)與Bcl-2的相互作用決定了胸腺細(xì)胞的發(fā)育過程［14，15］。急性梗阻性膽管炎宿主胸腺細(xì)胞凋亡情況的變化鮮有報(bào)道。有資料顯示TNF-α、內(nèi)毒素體內(nèi)外均可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡［16，17］。本研究同期進(jìn)行的相關(guān)生化等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組血漿內(nèi)毒素、TNF-α、IL-6、IL-8等增高，因此推測(cè)急性梗阻性膽管炎宿主胸腺細(xì)胞凋亡增多。本研究發(fā)現(xiàn)，與膽總管單純結(jié)扎組比較，模型組胸腺質(zhì)量明顯降低，胸腺指數(shù)降低（ P <0.01），胸腺皮質(zhì)變薄，胸腺細(xì)胞密度降低，凋亡指數(shù)增高（ P <0.05），并出現(xiàn)大量典型的凋亡小體，提示模型組胸腺細(xì)胞凋亡明顯增加，雖然鏡下觀察到模型組胸腺有少量點(diǎn)狀壞死灶，但這不應(yīng)成為胸腺質(zhì)量減輕的主要原因。結(jié)合同期其他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)外周血中CD3、CD4淋巴細(xì)胞減少是細(xì)胞免疫中樞胸腺細(xì)胞凋亡增多，導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞減少所致。 錦紅片治療組胸腺質(zhì)量及胸腺指數(shù)明顯高于模型組，表明中藥治療后胸腺受損程度明顯減輕，有保護(hù)胸腺的作用。并且錦紅片治療組胸腺凋亡指數(shù)明顯低于模型組，可以認(rèn)為，錦紅片能抑制胸腺細(xì)胞的過度凋亡，以此維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能的相對(duì)穩(wěn)定。中藥抑制胸腺細(xì)胞的凋亡可能與其誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受有關(guān)。有報(bào)道稱反復(fù)多次注射小劑量內(nèi)毒素的動(dòng)物其胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)及胸腺活細(xì)胞數(shù)均明顯高于一次注射大劑量內(nèi)毒素，而梯狀DNA則減少，并且，隨注射內(nèi)毒素量的增加，對(duì)胸腺的保護(hù)作用越強(qiáng)［1］。同期的研究中錦紅片治療組血漿內(nèi)毒素明顯低于模型組，實(shí)際起到了誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受、保護(hù)胸腺的作用。本研究錦紅片治療組Bcl-2基因編碼蛋白表達(dá)多于模型組，而且細(xì)胞凋亡也較少，F(xiàn)as基因編碼蛋白表達(dá)組間無明顯差異，推測(cè)具有清熱通下作用的中藥錦紅片可能是通過促進(jìn)Bcl-2基因編碼蛋白的表達(dá)而在一定程度上抑制了細(xì)胞凋亡。

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