【關(guān)鍵詞】  子宮內(nèi)膜異位癥；，孕激素；，孕激素酮

　　摘要： 目的 探討卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）病灶對生理狀態(tài)的孕激素水平反應(yīng)不良是否由局部孕激素受體亞型分布及數(shù)量改變或功能缺陷所致。方法 采用RTPCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，檢測45例EMS患者的卵巢異位子宮內(nèi)膜（卵巢EMS組）和在位內(nèi)膜（在位內(nèi)膜組）及35例其他患者的正常子宮內(nèi)膜（對照組）的孕激素受體PR（A+B）、孕激素受體亞型A、B（PRA、PRB）mRNA及其蛋白的表達(dá)。 結(jié)果（1）對照組和在位內(nèi)膜組的PR表達(dá)在增生期增強(qiáng)，并隨分泌期逐漸減弱；PRA占優(yōu)勢，PRB/PRA比值在整個(gè)月經(jīng)周期保持相對恒定。（2）卵巢EMS組PRA、PRB、PR（A+B）表達(dá)絕對低于對照組（P<0.01），無周期性變化。異位內(nèi)膜腺上皮PRA表達(dá)呈絕對降低，而間質(zhì)中PRB表達(dá)相對增高，PRA不占優(yōu)勢，PRB/PR（A+B）顯著增高（P<0.01）。結(jié)論異位子宮內(nèi)膜存在局部孕激素受體亞型數(shù)量和比值改變，可能是子宮內(nèi)膜異位癥孕激素抵抗現(xiàn)象的主要分子機(jī)制。

　　關(guān)鍵詞： 子宮內(nèi)膜異位癥； 孕激素； 孕激素酮

　　Expression of Progesterone Subtype  Receptors and Local Progesterone Resistance in Human Ovarian Endometriosis

　　Qu Junying， Ou Xianghong， Yang Daixing， Zhang Sheng， Lin Jing‘a(chǎn)n3， Ma Yanhui

　　1.Department of Obstetrics and Gynecology， The Affiliated First Hospital， Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China

　　2.Department of Reproductive Center， Chenzhou People‘`s Hospital， Chenzhou 423000， China

　　3.Department of Pathology， The Affiliated First Hospital， Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China

　　ABSTRACT： Objective To study the expression and distribution of progesterone subtype receptors（PR） in ovarian endometriosis.Methods  The levels of PR（A+B） were assessed by RTPCR and PR（A+B） protein were detected by immunohistochemical assay in 45 ovarian endometriosis and their eutopic endometrium and 35 normal endometrium during the same menstrual cycle. Results PR expression was gradually increased during proliferative phase in the normal endometrium and eutopic endometrium， but gradually decreased along with the secretary phase.PRA was dominant during the menstualmenstrual cycle.However， the ratio PRB/PRA was maintained relatively constant.  Compared with the normal endometrium， the expression of PRB and PR（A＋B） mRNA were lower（P<0.01） in ovarian endometriosis and showed no periodic variation during the menstrual cycle. In endometriotic gland epithelial cells， PRA protein was decreased absolutely， whereas in the stroma cell PRB expression was relatively increased and the ratio PRB/PR（A+B） was very significantly higher than that in normal endometrium（P<0.01）。        Conclusion A wide variety of concentrations of the PRB/PRA ratios in the endometriotic tissue might be considered as one of the molecular mechanisms of the progesterone resistance in endometriosis.

　　KEY WORDS： endometriosis； progestin； progesterone

　　子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是一種雌激素依賴性疾病，已有研究發(fā)現(xiàn)，盡管EMS患者的血清孕激素濃度與正常婦女相同，但腹腔液中孕激素（P）的水平卻是后者的3~4倍[1].臨床病理發(fā)現(xiàn)，異位腺上皮多數(shù)保持增生狀態(tài)，黃體期分泌反應(yīng)差甚至無反應(yīng)[2].Metzger報(bào)告用大劑量的孕激素治療1例EMS患者無效，術(shù)后病理報(bào)告異位內(nèi)膜增生活躍，免疫組織化學(xué)提示雌激素受體（ER）陰性，而孕激素受體（PR）陽性[3].Zong認(rèn)為這種孕激素抵抗現(xiàn)象可能是由于缺乏足夠有功能的PR基因[4].筆者設(shè)想，可能由于孕激素受體亞型改變，導(dǎo)致孕激素作用缺陷和局部雌激素代謝異常，特研究異位子宮內(nèi)膜孕激素受體亞型的表達(dá)及與該現(xiàn)象有關(guān)的分子機(jī)制，報(bào)告如下。

　　1 對象與方法

　　1.1 對象

　　卵巢EMS患者為2003年11月~2004年12月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及福建省婦幼保健院行腹腔鏡或開腹手術(shù)獲取的卵巢異位子宮內(nèi)膜，共45例（卵巢EMS組），其中35例同時(shí)刮取子宮前、后壁內(nèi)膜組織各1條（在位內(nèi)膜組）。同法另取35例未經(jīng)放、化療治療的宮頸癌Ⅰa~Ⅱa患者的子宮標(biāo)本內(nèi)膜，以其代表正常子宮內(nèi)膜（對照組）。所有入選病例均為已婚，術(shù)前未用任何激素類藥物治療，無內(nèi)科合并癥，有正常月經(jīng)周期（26~31 d），年齡（29±5）歲（23~40歲）。

　　實(shí)驗(yàn)前將卵巢異位子宮內(nèi)膜標(biāo)本行HE染色，光鏡下可見子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞者入選卵巢EMS組。在位內(nèi)膜組和對照組子宮內(nèi)膜月經(jīng)期根據(jù)其月經(jīng)周期推算，并符合Noye‘s分期病理學(xué)圖像[5].

　　1.2 材料

　　1.2.1 引物

　　由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為：PR（A＋B）上游（1950~1967 bp）：5‘AGC CGG TCC GCG TCC AAG3’下游（2174~2191 bp）：5‘CCA CCC AGA GCC CGA GGG3 PRB上游（4~24 bp）：5’ACT GAG CTG AAG GCA AAG GGT3下游（186~204 bp）：5‘GTC CTG TCC CTG GCA GGG C3’PR（A＋B）和PRB目的基因片斷分別為242和201 bp.βactin（內(nèi)參基因）引物序列： 上游：5‘GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC3’ 下游：5‘ATG TCA CGC CAC GAT TTC CCG C3’管家基因片斷500 bp.以上引物均參照說明書用焦碳酸二乙醇（DEPC）水溶解，終濃度為1 pmol/μL.

　　1.2.2 RTPCR試劑

　　Trizol（RNA提取試劑，美國Promega公司），MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)（美國MBI公司）；5 U/μL Taq DNA聚合酶（上海博亞生物技術(shù)有限公司）。

　　1.2.3 免疫組織化學(xué)試劑

　　鼠抗人PR（A+B）是總的孕激素受體（包含PRA和PRB）結(jié)合的單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。鼠抗人PRA、PRB的單克隆抗體，選擇克隆型號hPRa7的一抗，只能識別PRA，不能識別PRB；hPRa2型單克隆抗體特異性識別PRB（美國NeoMarkers公司）。二抗為羊抗鼠免疫球蛋白（美國Dako公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  取材

　　所有標(biāo)本取材后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗標(biāo)本3次，在離體后20 min內(nèi)取新鮮組織50 mg立即凍存于-72 ℃冰箱。卵巢異位子宮內(nèi)膜組織經(jīng)HE染色，鏡下確定異位腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞。所有待檢標(biāo)本于2 h內(nèi)提取總RNA，并立即逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱中備用。一部分標(biāo)本立即固定于4％多聚甲醛，乙醇脫水，石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片。

　　1.3.2  RTPCR擴(kuò)增PR（A＋B）、PRB

　　按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行，應(yīng)用反應(yīng)體系50 μL，94 ℃預(yù)變性4 min后，按照94 ℃ 30 s→60 ℃ 60 s→72 ℃ 120 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.

　　1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測PR（A＋B），PRB，PRA

　　采用免疫組織化學(xué)兩步法（labbled dextran polymer method，LDP）進(jìn)行。

　　1.4  結(jié)果判斷

　　1.4.1 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

　　取PCR產(chǎn)物8 μL，置1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，以puc Mix Marker作為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)果用凝膠掃描分析系統(tǒng)（GD2000）對目的基因及βactin進(jìn)行光密度掃描，以目的基因與βactin基因光密度比值反映該基因mRNA的相對表達(dá)水平。

　　1.4.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果判斷

　　由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3種抗體都表達(dá)在腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)，陽性染色者細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒沉著。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：選擇具有代表性的有異位腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的10個(gè)高倍鏡視野（×400）觀察，并隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果依染色強(qiáng)弱和染色百分比兩項(xiàng)來評分。得分標(biāo)準(zhǔn)：弱表達(dá)為1分，中度表達(dá)為2分，強(qiáng)表達(dá)為3分，無表達(dá)為0分；半定量得分＝∑陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)[3].

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，等級資料采用頻數(shù)計(jì)數(shù)，非參數(shù)檢驗(yàn)（MannWhitney test）。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2  結(jié)果

　　2.1  PR（A+B）、PRB mRNA在3組子宮內(nèi)膜的表達(dá)

　　2％瓊脂糖電泳，發(fā)現(xiàn)在同一泳道201，242，500 bp處分別可見PRB、PR（A+B）和βactin產(chǎn)物的清晰條帶，周圍無雜帶（圖1，2）。115例均見內(nèi)參照βactin mRNA的表達(dá)。                M：DNA marker； 1：同增生期卵巢異位內(nèi)膜PR（A+B）； 2：同增生期卵巢異位內(nèi)膜PRB； 3： 同分泌期卵巢異位內(nèi)膜PR（A＋B）； 4： 同分泌期卵巢異位內(nèi)膜PRB.        PR：孕激素受體。

　　2.1.1  對照組

　　子宮內(nèi)膜PR（A+B）和PRB mRNA增生期較分泌期表達(dá)高（P<0.01），至增生晚期達(dá)高峰，分泌期逐漸減少，分泌晚期幾乎無表達(dá)，呈周期性改變。但各月經(jīng)期別間PRB/PR（A+B）mRNA比率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），基本保持一恒定水平（表1）。

　　2.1.2 在位內(nèi)膜組

　　與月經(jīng)周期中EMS組與對照組內(nèi)膜PR（A+B）、PRB mRNA及PRB/PR（A+B）表達(dá)的規(guī)律性和量比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

　　2.1.3 卵巢EMS組

　　與對照組比較，卵巢EMS異位內(nèi)膜的PR（A+B）和PRB mRNA總的表達(dá)量顯著減少（P<0.01），并且無明顯周期性變化，使分泌晚期的PRB mRNA表達(dá)相對高于同期的對照組；PRB/PR（A+B）mRNA的比值顯著高于對照組和在位內(nèi)膜組（P<0.01），說明卵巢EMS組主要以PRB表達(dá)為主，PRA表達(dá)顯著減少（圖2，表1）。表1 3組子宮內(nèi)膜PR（A+B）、PRB mRNA在EMS、在位內(nèi)膜、對照組子宮內(nèi)膜的表達(dá)（略）

　　2.2 PR（A+B）、PRA和PRB蛋白在3組、內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

　　2.2.1 對照組

　　腺上皮細(xì)胞同一細(xì)胞核內(nèi)既表達(dá)PRA又表達(dá)PRB，增生期PRA和PRB表達(dá)相近；增生中晚期達(dá)高峰；自分泌早期始，PRA和PRB減少，分泌晚期幾乎無表達(dá)。整個(gè)月經(jīng)周期間質(zhì)主要以PRA表達(dá)為主，PRB表達(dá)少，增生中晚期達(dá)高峰，至分泌晚期仍有散在的細(xì)胞表達(dá)PRA（圖3）。

　　2.2.2 在位內(nèi)膜組

　　腺上皮和間質(zhì)中PRA、PRB的表達(dá)量和表達(dá)特征與對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

　　2.2.3 卵巢EMS組

　　腺上皮細(xì)胞PR（A＋B）表達(dá)少于對照組（P<0.01），以卵巢EMS單層的腺上皮減少為著，但有完整腺體的腺上皮細(xì)胞PR表達(dá)高于前者；異位腺上皮中PRB和PRA蛋白表達(dá)水平均明顯低于對照組（P<0.01）；異位間質(zhì)細(xì)胞PR（A＋B）水平與對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但PRB的表達(dá)顯著高于對照組（P<0.01）；異位腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞PRB/PRA和PRB/PR（A+B）均顯著高于對照組；異位內(nèi)膜PR（A＋B）、PRA和PRB的表達(dá)無周期性改變，分泌期間質(zhì)中PRB、PRA表達(dá)相對高于同期對照組（表2）。表2 對照組與卵巢EMS組PR（A+B）、PRA和PRB蛋白在內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)（略）

　　3 討論

　　3.1子宮內(nèi)膜PR亞型及其功能

　　人PR有多種亞型如PRA、PRB、PRC、PRM等，目前研究較多的是含933個(gè)氨基酸的PRB和在氨基末端被截短164個(gè)氨基酸的PRA，二者為同一基因編碼，其mRNA N末端含有2個(gè)AUG （其1位于744 bp，其2位于1 236 bp） 分別是PRB和PRA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，由兩個(gè)不同的啟動子A，B轉(zhuǎn)錄成不同的PRA和PRB mRNA.PRB和PRA mRNA都有4個(gè)外顯子，兩個(gè)mRNA除了PRB的第一個(gè)外顯子比PRA長492 bp外，其他序列一致。故反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，只能針對PRB第一個(gè)外顯子特異的492 bp區(qū)設(shè)計(jì)特異性PRB的引物，不能設(shè)計(jì)PRA的特異引物，但能在PRA、PRB的共同區(qū)設(shè)計(jì)既能針對PRA，又能針對PRB擴(kuò)增的引物[6].本實(shí)驗(yàn)用RTPCR的實(shí)驗(yàn)方法只能擴(kuò)增出PRB和PR（A＋B）基因，不能擴(kuò)增出PRA基因。已有研究發(fā)現(xiàn)，PRB活化轉(zhuǎn)錄作用強(qiáng)于PRA，能調(diào)節(jié)內(nèi)膜腺上皮的有絲分裂和分泌，在沒有PRA拮抗時(shí)，PRB表現(xiàn)為促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮增生。PRA調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂和分化，同時(shí)PRA不僅拮抗雌激素介導(dǎo)的上皮增生，還可拮抗PRB誘導(dǎo)的上皮增生。通常PR以二聚體形式存在，靶細(xì)胞中PRA、PRB蛋白比率不同可能會改變各種二聚化的相對成分，從而影響整個(gè)細(xì)胞對孕激素的反應(yīng)[7].

　　3.2 異位內(nèi)膜PRA、PRB表達(dá)改變與孕激素抵抗的關(guān)系Misao等用RTPCR檢測卵巢EMS組織，發(fā)現(xiàn)PRB/PRA明顯高于在位內(nèi)膜，提示卵巢異位子宮內(nèi)膜組織PRB優(yōu)勢表達(dá)可能是導(dǎo)致異位灶異常增生的原因[8]，而Attia等未能在腹膜的異位內(nèi)膜組織檢測出PRB蛋白，推論僅有PRA的存在抑制了孕激素的作用[9].本組資料表明：（1）正常子宮內(nèi)膜的PR表達(dá)在增生期增強(qiáng)，并隨分泌期逐漸減弱；PRA占優(yōu)勢，但PRB/PRA比值在整個(gè)月經(jīng)周期中保持相對恒定。（2）卵巢異位子宮內(nèi)膜中PRA，PRB，PR（A＋B）表達(dá)絕對低于正常（P<0.01），并且無周期性變化；（3）異位內(nèi)膜腺上皮PRA表達(dá)呈絕對降低，而間質(zhì)中PRB表達(dá)卻相對增高，PRA不占優(yōu)勢，PRB/PR（A＋B）顯著增高（P<0.01）。這一變化使腺上皮由于PR的減少而對孕激素反應(yīng)差，孕激素?zé)o法發(fā)揮其拮抗雌激素的促增生分裂作用；而局部PRB/PRA比值增高，增強(qiáng)了PRB促上皮增生作用，可能與卵巢異位內(nèi)膜在整個(gè)月經(jīng)周期都保持增生期狀態(tài)有關(guān)。Kurita等認(rèn)為，雌二醇（E2）誘導(dǎo)的上皮DNA合成是由間質(zhì)中的PR調(diào)節(jié)，其中的PRA、PRB和ERα可能是間質(zhì)因子之一[10].本研究所見異位內(nèi)膜間質(zhì)PRB表達(dá)相對增高和PRB/PR（A＋B）比值變化正是一種間質(zhì)依賴的上皮生長信號的重要環(huán)節(jié)，它促進(jìn)了雌激素依賴的內(nèi)膜增生作用，從而表現(xiàn)EMS患者對生理濃度甚至大劑量孕酮反應(yīng)差，即所謂“孕激素抵抗現(xiàn)象”。

　　本研究結(jié)果提示，異位子宮內(nèi)膜存在局部PR亞型數(shù)量和比值改變，可能是導(dǎo)致異位子宮內(nèi)膜病灶對體內(nèi)生理濃度孕激素缺乏反應(yīng)，對治療量孕激素反應(yīng)不良甚至促進(jìn)生長的主要原因，是子宮內(nèi)膜異位癥孕激素抵抗現(xiàn)象的主要分子機(jī)制之一。其中異位病灶間質(zhì)的孕激素亞型受體改變，可能與局部雌激素代謝和信號傳導(dǎo)有關(guān)，與EMS的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

　　（致謝：本研究中有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)部分得到福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院林旭教授的悉心指導(dǎo)，特此致謝。）

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]Tsai S J，Wu M H，Lin C C，et al. Regulation of steroidogenic acute regulatory protein expression and progesterone production in endometriotic stromal cells[J]. Clin Endocrinol Metab， 2001，86（12）：57655773.

　　[2]顧玲芬，張麗珠，顧方穎，等。 子宮內(nèi)膜異位癥異位與在位內(nèi)膜發(fā)育日期及雌激素、孕激素受體水平[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志， 1996，31（10）：582585.

　　[3]Metzger D A，Lessey B A，Soper J T，et al. Hormoneresistant endometriosis following total abdominal hysterectomy and bilateral salpingooophorectomy：correlation with histology and steroid receptor content[J]. Obstet Gynecol， 1991，78（5 Pt 2）：946950.

　　[4]Fang Z J，Jang S J，John P. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis[J]. Fert Steril， 2004，82（3）：673678.

　　[5]Robboy S J，Anderson M C，Russell P. 女性生殖道病理學(xué)[M]. 16版， 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社， 2005：248.

　　[6]Sasaki M，Dharia A，Bong R. Progesteone receptor B gene inactivation and CpG hypermethylation in human uterine endometrial cancer[J]. Cancer Res， 2001，61：97102.

　　[7]Utsunomiya H，Suzuki T，Ito K，et al. The correlation between the response to progesterone treatment and the expresssion of progesterone receptor and 17bhydroxysteroid dehydrogenase type 2 in human endometria carcinoma[J]. Clin Endocrinol， 2003，58（6）：696703.

　　[8]Misao R，Iwagaki S，F(xiàn)ujimoto J. Documant expression of progesterone receptor from B mRNA in ovarian endometriosis[J]. Horm Res， 1999，52（1）：3034.

　　[9]Attia G R，Zeitoun K，Edwards D，et al. Progesterone receptor isoform A but not B is expressed in endometriosis[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2000，85（8）：28972902.

　　[10]Kurita T，Young P，Brody J R. Stromal progesterone receptor mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogeninduced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis[J]. Endocrinology， 1998，139（11）：47084713.