【摘要】  目的 探討銀環(huán)蛇毒中毒檢測中不同材料與不同方法的優(yōu)缺點。方法 采用雙向免疫擴散法與間接ELISA法對銀環(huán)蛇毒中毒的人與動物的不同標本進行檢測。結(jié)果 雙向免疫擴散法死者傷口皮膚組織液、死者心臟血清、死小豬傷口皮膚組織液及死小豬血清標本均未見免疫沉淀帶；ELISA法測標本均為陽性。結(jié)論 銀環(huán)蛇毒中毒檢測中傷口皮膚組織液和血液都是合適的材料；雙向免疫擴散法的檢出率較低，而ELISA法則是一種較好的檢測方法。

　　【關(guān)鍵詞】  銀環(huán)蛇毒；免疫電泳法；酶聯(lián)免疫吸附法

　　Study on methodology for detection of banded krait venom

　　QIN Yuan，GU Shao-ju.Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182，China

　?。跘bstract］  Objective  To compare the advantages and disadvantages of different samples and different methods in detection for banded krait venom.Methods  Double immunodiffusion and enzymelinked immunosorbent assay were used as the methods to detect different samples of people and animal who were bit by banded krait.Results  In double immunodiffusion the samples were all negative；with ELISA the samples of wound tissue liquid and blood were all positive.Conclusion  Wound tissue liquid and blood are both fitting samples in detection for banded krait venom；double immunodiffusion isn‘t adapt to detect banded krait biting patient，but ELISA is an good detection method.

　?。跭ey words］  banded krait venom；immunoelectrophoresis；enzymelinked immunsorbent assay

　　毒蛇咬傷為比較常見的急癥之一，近年來隨著人民生活水平的提高，食蛇、用蛇的人日益增多，毒蛇咬傷病例逐年大幅度增加。蛇傷的發(fā)生具有突發(fā)性，且病情危急、病程進展快，常常引起人體臟器的損傷和衰竭，輕者致肢體傷殘、重者則引起死亡［1］。而今蛇傷的診斷主要依靠病史和臨床表現(xiàn)，因為有重疊特征，要判斷所咬傷的蛇的種類很困難，僅僅從臨床表現(xiàn)判斷，有時會發(fā)生誤判，導致患者不能及時得到治療，蛇傷快速診斷方法對于臨床蛇傷的正確診治具有極為重要的意義［2］。同時近年蛇毒中毒的案件也時有發(fā)生，判斷是否為蛇毒中毒，為何種蛇毒中毒，使得蛇毒檢驗具有更廣泛的意義［3］。

　　銀環(huán)蛇毒素是從銀環(huán)蛇的毒腺中分泌出來的毒液，新鮮毒液呈灰白色、黏稠、具有特殊的腥味。銀環(huán)蛇一次排毒量約4.6 mg，人致死量1 mg干毒，是世界十大毒蛇之一［4］。由于其排毒量較少，增加了其檢測的難度。筆者報告銀環(huán)蛇咬死者1例，同時用小豬作對照采用不同方法檢測不同的標本，以探討銀環(huán)蛇毒中毒的檢測不同材料與方法的優(yōu)缺點。

　　1  材料與方法

　　1.1  參考標準蛇毒  準確稱取本所精制銀環(huán)蛇粗毒，濃度梯度：0.25 ng/ml、1 ng/ml、4 ng/ml、16 ng/ml、64 ng/ml.

　　1.2  抗原標本  銀環(huán)蛇咬死者傷口皮膚組織液，死者心臟血清；銀環(huán)蛇咬死小豬傷口皮膚組織液，死小豬血清。

　　1.3  陰性標本  正常人血清，死者周邊皮膚組織液，正常豬血清，小豬周邊皮膚組織液。

　　1.4  方法

　　1.4.1  雙向免疫擴散法  用pH 8.6的巴比妥鈉緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，厚度2～3 mm，自然冷卻后打孔（3 mm），孔距10 mm，挑出孔內(nèi)瓊脂，在火焰上緩緩加熱以封底，中心孔加抗銀環(huán)蛇血清，周圍孔加蛇毒及被檢抗原，每孔加液量均為15 L，置37 ℃水浴箱24～48 h，觀察結(jié)果。標準陽性血清和被檢抗原之間出現(xiàn)白色沉淀線者為陽性，不出現(xiàn)沉淀線者為陰性。

　　1.4.2  間接ELISA法  以標準蛇毒及抗原標本包被96孔酶標板，37 ℃溫育2 h，取出后以pH 7.4 PBS－Tween 20 （0.05 %） 緩沖液洗板3次；再以含3 % BSA 的PBS－Tween 20 （0.01 %） 封閉液每孔100 μl封閉酶標板，37 ℃溫育90 min，洗板3次；馬抗銀環(huán)蛇毒抗體配成濃度為10 μg/ml的工作液，以0.1 ml/孔加入到上述酶標板中，37 ℃溫育30 min，PBS洗板3次；加入兔抗馬IgG－HRP （按1∶5000稀釋）100 μl，37 ℃溫育1 h；洗滌后每孔加40%鄰苯二胺底物溶液0.1 ml，37 ℃避光孵育10 min，每孔用100 μl 4M H2SO4 終止反應(yīng)；490 nm測光吸收值。

　　2  結(jié)果

　　2.1  雙向免疫擴散法  免疫電泳法：觀察48 h內(nèi)免疫電泳擴散結(jié)果：蛇毒抗原可見免疫沉淀帶；死者傷口皮膚組織液、死者心臟血清、死小豬傷口皮膚組織液及死小豬血清均未見免疫沉淀帶（圖1）。

　　2.2  間接ELISA法  蛇毒抗原0.25～250 ng/ml濃度的吸光值呈明顯的濃度梯度。死者傷口皮膚組織液、死者心臟血清、死小豬傷口皮膚組織液及死小豬血清均為陽性（表1、表2）。表1  標準蛇毒的間接ELISA法的吸光度均值標準蛇毒梯度表2  不同標本的間接ELISA法的吸光度均值

　　3  討論

　　蛇毒是一類含有多種生物活性蛋白和多肽的混合物，它的成分復(fù)雜，要從可疑含蛇毒的生物性樣本中分離、檢測某種蛇毒蛋白困難很大，但由于蛇毒蛋白具有種屬特異性，因此可根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，用免疫學方法利用種屬特異性抗體檢測樣本中相應(yīng)的蛇毒抗原［5］。

　　人們一般用家兔作為蛇咬傷的實驗動物，但其體重及體表與人相差較遠，筆者選用小豬作為實驗動物，采用蛇咬小豬而更準確的模擬了蛇咬人的過程，從而獲得更準確的樣品標本。從表2中數(shù)據(jù)可知銀環(huán)蛇毒中毒傷口皮膚組織液檢出值較高，血液次之，兩者都是蛇毒中毒檢驗中合適的材料。對于銀環(huán)蛇咬致死的案件，死者的傷口皮膚組織液比血液更易采集。而患者則可以通過血液監(jiān)測蛇毒的含量變化，用于指導臨床治療。

　　雙向免疫擴散法的設(shè)備簡單、操作方便，但靈敏度較低；而銀環(huán)蛇排毒量很少，在血液中通常只達到納克級，使其不能對蛇傷做出有效診斷，且由于檢測時間過長，不能及時指導臨床治療，所以雙向免疫擴散法不適用于銀環(huán)蛇毒中毒患者的檢驗。但由于其假陽性率低，對于蛇毒致死案件的鑒定有一定意義。

　　而ELISA法則是一種較好的檢測方法，其優(yōu)點在于：（1）靈敏度高，大部分蛇咬傷的病例中，蛇毒的濃度一般在納克級范圍內(nèi)，所以要求檢測方法必須非常靈敏。ELISA法的靈敏度可達到納克甚至皮克水平；（2）快速性；（3）方便性，可直接采用中毒者的血液、傷口組織液進行檢測。同時微量ELISA方法對對蛇傷的免疫學和流行病學的研究具有重要意義。然而非特異性反應(yīng)仍是干擾ELISA檢測準確性的主要因素。

　　隨著生物傳感器的快速發(fā)展，其體積的小型化、檢測時間縮短、靈敏度提高使其成為最適于在野外使用的蛇毒檢測方法。Rogers等［6］將煙堿型乙酰膽堿受體固定于光纖上，制成煙堿型乙酰膽堿受體生物傳感器，利用其可以和金環(huán)蛇毒特異結(jié)合的特性，檢測蛇毒的濃度。我們正研究以制備的雞卵黃抗蛇毒抗體為基礎(chǔ)，研制蛇傷快速診斷蛋白傳感芯片。

　　【參考文獻】

　　1 譚杜勛。南方毒蛇傷的流行病學特點與急診救治。中國急救醫(yī)學，1999，19（3）：181.

　　2 余清聲，賴振添。蛇傷急救的基礎(chǔ)與臨床。通用危重病急救醫(yī)學。天津：天津科技翻譯出社，2001，1360-1378.

　　3 李峰，夏為民，蘭秀康。注射銀環(huán)蛇毒殺人1例。法醫(yī)學雜志，2004，20（2）：127.

　　4 覃公平。中國毒蛇學。南寧：廣西科學技術(shù)出版社，1995，776-780.

　　5 Bhatti AR，Wong JP，Siddiqui YM，et al.A sensitive fluorogenic enzyme linked immunosorbent assay for the detection of Vipera russelli venom.Nat Toxins，1993，1（5） ：277-282.

　　6 Rogers KR，Valdes JJ，Eldefrawi ME.Effects of receptor concentration，media pH and storage on nicotinic receptortransmitted signal in a fiberoptic biosensor.Biosens Bioelectron，1991，6（1）：1-8.