【摘要】目的：觀察選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑依托昔布對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟病變的影響。

　　方法：將大鼠隨機(jī)分為單側(cè)輸尿管梗阻組，依托昔布治療組和對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定血肌酐、尿素氮和腎皮質(zhì)NO含量，并用免疫組化法半定量測定腎組織TGFβ1和COX2的表達(dá)水平。 結(jié)果：單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后3 wk，單側(cè)輸尿管梗阻組和用藥組大鼠腎臟均可見明顯病理改變與纖維化，血肌酐［（38.10±3.93，27.80±2.57） mL/min］、尿素氮［（9.18±0.03，8.14±0.03） mmol/L］和腎皮質(zhì)NO含量［（6.01±0.17，4.47±0.12） mmol/L］均比對(duì)照組［（22.30±2.28） mL/min， （6.53±0.02） mmol/L， （1.65±0.11） mmol/L］顯著性升高，腎組織TGFβ1（2.41±0.19，1.38±0.13）和COX2（2.74±0.07，1.52±0.05）的表達(dá)水平顯著性上調(diào)。 用藥組與單側(cè)輸尿管梗阻組比較，病理改變與纖維化程度，血肌酐、尿素氮和腎皮質(zhì)NO含量、腎組織TGFβ1和COX2的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

　　結(jié)論：特異性COX2抑制劑依托昔布能減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟病理損傷和纖維化改變。

　　【關(guān)鍵詞】 輸尿管梗阻 纖維化 環(huán)氧化酶2 依托昔布

　　0.引言

　　環(huán)氧化酶（cyclooxygenase， COX）包括 COX1和COX2兩種同工酶，目前認(rèn)為是前列腺素代謝環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵性限速酶，COX1參與正常生理過程，而COX2可介導(dǎo)病理改變［1］。 研究結(jié)果顯示，COX2大量生成在輸尿管梗阻所引發(fā)的腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用［2］，并發(fā)現(xiàn)COX2在腎皮質(zhì)的過度表達(dá)可能是腎內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和聚集的起始或促進(jìn)因素之一。 而臨床上用非甾體類抗炎藥（nonsteroid antiinflammatory drugs， NSAIDs）治療腎臟炎性疾病引起不良反應(yīng)可能與NSAIDs在阻斷COX2催化的病理性前列腺素合成的同時(shí)，也阻斷了COX1催化的生理性前列腺素的合成有關(guān)。 為了探討通過選擇性地阻斷COX2的合成，避免NSAIDs的不良反應(yīng)的有效途徑［3］，我們用單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型［4］，觀察腎組織中COX2和TGFβ1的改變及其在輸尿管梗阻所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察選擇性COX2抑制劑依托昔布（Etoricoxib）對(duì)梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的影響及對(duì)腎臟的保護(hù)作用，為治療相關(guān)腎臟損傷提供基礎(chǔ)。

　　1.材料和方法

　　1.1材料健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180~220 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)，濕度55%，溫度22℃，晝夜燈光照明，定期消毒籠具。 依托昔布由北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司提供。 山羊抗大鼠COX2多克隆抗體、兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體為Santa Crutz公司產(chǎn)品。

　　1.2方法

　　1.2.1單側(cè)輸尿管梗阻模型動(dòng)物平均分為對(duì)照組、單側(cè)輸尿管梗阻組和依托昔布治療組。 對(duì)照組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其余步驟同其它兩組。 治療組于術(shù)前24 h開始給予依托昔布，每日10 mg/kg溶于1 mL生理鹽水中灌胃，梗阻組僅以等量生理鹽水灌胃。 0.1 g/L水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉梗阻組和依托昔布治療組大鼠。 于背部左側(cè)縱形切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露左側(cè)腎臟，分離輸尿管，分別在緊貼腎門處及遠(yuǎn)端結(jié)扎輸尿管，于兩結(jié)扎處之間剪斷，逐層縫合肌肉、皮膚，以碘伏消毒。 術(shù)后肌肉注射羅氏芬預(yù)防感染，每日1.5 mg/kg，連續(xù)3 d. 腎臟取材與保存：術(shù)后第3周，在采集血液標(biāo)本后，手術(shù)取出大鼠左腎，剝離腎包膜，將腎臟沿縱軸剖開，取適量皮質(zhì)組織作NO含量測定用，其余組織迅速保存在中性甲醛中以備組織學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色用。

　　1.2.2血液生化指標(biāo)測定將術(shù)后第3周采集血液標(biāo)本離心，取血清，在全自動(dòng)生化分析儀上測定血肌酐與尿素氮。

　　1.2.3腎皮質(zhì)NO含量測定取約0.5 g左腎組織，加入4 mL 4℃生理鹽水中，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制成勻漿，4℃，1000 r/min，離心5 min，取上清液-20℃保存待測。 用硝酸還原酶法測定NO含量，按試劑盒檢測步驟，分別在空白管，標(biāo)準(zhǔn)管，測定管中滴加試劑，混勻，37℃水浴60 min，再次滴加試劑，充分旋渦混勻30 s，室溫靜置10 min， 4000 r/min離心10 min，取上清，分別加入顯色劑，混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，550 nm， 0.5 cm光徑比色測定各管吸光度值，NO含量（μmol/L）=［（樣品管吸光度-空白管吸光度）或（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)值］÷樣品的蛋白濃度（g/L）。［醫(yī)學(xué)　教育網(wǎng) 搜集整理］

　　1.2.4Masson和免疫組織化學(xué)染色腎組織固定后石蠟包埋。 3 μm連續(xù)切片。 Masson染色：切片脫蠟水化，蒸餾水浸洗3次，每次3 min. 用Masson復(fù)合染液浸染10 min，冰醋酸沖洗。 磷鎢酸分化10 min，冰醋酸沖洗。 苯胺藍(lán)染色4 min，冰醋酸沖洗。 最后用蒸餾水浸洗2次，每次5 min. 干燥后用中性樹膠封片。 免疫組織化學(xué)染色：切片脫蠟水化后， 用PBS （pH 7.4， 10 mmol/L）浸洗。 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育，PBS洗后浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0， 10 mmol/L），微波修復(fù)（2450 mHz， 800 W），加蒸餾水50 mL后冷卻。 PBS液浸洗；用正常山羊血清封閉，室溫孵育。 傾去血清，加入一抗（兔抗大鼠TGFβ1抗體，1∶400稀釋；山羊抗大鼠COX2抗體，1∶100稀釋），4℃冰箱過夜，復(fù)溫， PBS浸洗。 滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室溫孵育。 PBS液浸洗，再滴加鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶，室溫孵育。 PBS液浸洗，顯色劑DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。 以正常兔或山羊血清代替一抗作陰性對(duì)照，免疫組化結(jié)果均為陰性。

　　1.2.5結(jié)果判定腎小管間質(zhì)病變（腎小管擴(kuò)張或萎縮、間質(zhì)細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化）程度的判定按Priraini法評(píng)分（0分：小管間質(zhì)無病變；1分：輕度病變，范圍<20%；2分：中度病變，范圍20%~40%； 3分：重度，病變范圍>40%）。 每例切片記錄連續(xù)不重疊的20個(gè)低倍視野的數(shù)值，取平均值。 對(duì)TGFβ1和COX2的表達(dá)，根據(jù)著色范圍進(jìn)行半定量分析（0分：無著色；0.5分：微量著色，面積占整個(gè)視野的10%以下；1分：輕度著色，著色面積占整個(gè)視野的10%~30%；2分：中度著色，著色面積占整個(gè)視野的30%~50%；3分：廣泛著色，著色面積占整個(gè)視野的50%以上）。 每例切片記錄20個(gè)連續(xù)不重疊的腎皮質(zhì)間質(zhì)高倍視野（盡量避開腎小球和大血管），取平均值。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 10.0做統(tǒng)計(jì)分析， 所用統(tǒng)計(jì)方法為方差分析， P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

　　2.結(jié)果

　　2.1腎臟大體形態(tài)與病理學(xué)所見梗阻組動(dòng)物左側(cè)腎臟輸尿管結(jié)扎術(shù)后3 wk，腎臟明顯腫大，顏色變淺，剖面呈缺血狀，以腎皮質(zhì)為重。 腎盂、腎盞擴(kuò)張明顯，充滿尿液，腎實(shí)質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)界限模糊不清。 經(jīng)Masson染色后對(duì)照組比較，腎間質(zhì)明顯增寬，其中有大量炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化明顯。 與治療組比較，依托昔布能夠明顯地改善單側(cè)輸尿管梗阻時(shí)的病理改變，鏡下可見間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞減少，纖維化明顯減輕。

　　2.2生化指標(biāo)輸尿管結(jié)扎術(shù)后3 wk，梗阻組和治療組尿素氮與血肌酐定量均比對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明梗阻性腎的損傷。 而治療組與梗阻組之間尿素氮與血肌酐定量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明依托昔布對(duì)腎損傷有保護(hù)作用（表1）。

　　2.3腎組織勻漿NO含量變化術(shù)后3 wk， 三組比較， 腎皮質(zhì)勻漿NO2-/NO3-含量變化非常顯著， 治療組與梗阻組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05， 表1）。 表明NO參與了梗阻性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程， 而依托昔布可以降低NO的合成。 表1尿素氮、血肌酐、NO含量及TGFβ1 COX2半定量計(jì)分比較

　　2.4腎小管間質(zhì)TGFβ1的表達(dá)術(shù)后3 wk，三組比較，腎小管間質(zhì)TGFβ1表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色半定量計(jì)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 梗阻組與治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。 表明TGFβ1參與了梗阻性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程，而依托昔布可以降低TGFβ1的生成。［醫(yī)　學(xué)教育網(wǎng) 搜　集整理］

　　2.5腎小管間質(zhì)COX2的表達(dá)治療組和梗阻組與對(duì)照組比較COX2表達(dá)明顯增加，而治療組和梗阻組之間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，表1）。 表明COX2參與了梗阻性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程，而依托昔布可以減少COX2的生成。

　　3.討論

　　本研究中，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠在其梗阻3 wk后，可見腎間質(zhì)增寬，炎癥細(xì)胞浸潤，部分腎小管萎縮，腎小管間質(zhì)明顯纖維化，血肌酐與尿素氮水平上升，表明腎功能受損。 腎皮質(zhì)勻漿NO含量升高，腎小管間質(zhì)TGFβ1的表達(dá)和COX2的表達(dá)上調(diào)，提示二者參與了腎損傷的發(fā)生發(fā)展。 單側(cè)輸尿管梗阻后使用依托昔布的大鼠，腎功能損傷和腎小管間質(zhì)纖維化程度明顯減輕。 據(jù)此我們推論，依托昔布對(duì)于大鼠單側(cè)輸尿管梗阻病變具有保護(hù)作用。

　　目前已經(jīng)開發(fā)出多種選擇性COX2抑制劑（可分為第一代和第二代），臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎［5-6］，然而有關(guān)選擇性抑制COX2對(duì)各種腎臟疾病影響的研究較少。 有關(guān)學(xué)者［7-8］用大鼠腎大部切除2 wk的模型研究發(fā)現(xiàn)，腎臟致密斑及皮質(zhì)升支粗段的COX2表達(dá)顯著增加，而COX1無明顯變化；使用COX2抑制劑可以有效減少前列腺素的生成，延緩腎小球硬化的病程進(jìn)展。 而用COX1抑制劑卻無效。 有關(guān)學(xué)者［9］提出，COX2在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎皮質(zhì)的過度表達(dá)很可能是腎內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和積聚的起始或促進(jìn)因素之一，但迄今尚未見COX2與腎小管間質(zhì)纖維化的相關(guān)性研究報(bào)道。 本研究表明，COX2參與了單側(cè)輸尿管梗阻后腎損傷發(fā)生和發(fā)展的病理過程，并在大鼠梗阻性腎損傷的腎間質(zhì)纖維化的過程中有重要作用。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)，第二代高特異性COX2抑制劑依托昔布能夠減輕腎功能損傷和腎組織纖維化進(jìn)展，抑制NO活性，下調(diào)TGFβ1和COX2的表達(dá)，從多方面發(fā)揮對(duì)梗阻性腎損傷的保護(hù)作用。

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