【摘要】  共納入80只無特定病原體級大鼠，將60只造成結(jié)腸慢輸型便秘模型，并隨機分為模型組、西沙比利組和益氣開秘方組（簡稱中藥組），其余20只設為正常對照組。以碳末推進百分率、離體腸肌條收縮頻率及振幅、一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase-1， NOS1）和P物質(zhì)為觀察指標。結(jié)果：模型組的碳末推進百分率較正常對照組明顯降低（ P <0.05），中藥組和西沙比利組均明顯高于模型組 （ P <0.05） .模型組與正常對照組相比，其各腸段腸肌條收縮的頻率和振幅明顯降低，中藥組和西沙比利組與模型組比較均有提高（ P <0.05）。模型組結(jié)腸腸壁組織NOS1陽性細胞面積百分比明顯高于正常對照組、西沙必利組和中藥組，中藥組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（ P >0.05）。模型組P物質(zhì)陽性細胞面積百分比較正常對照組明顯下降，中藥組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（ P >0.05）。結(jié)論：益氣開秘方可通過提高大鼠腸道平滑肌收縮的頻率和振幅來促進腸道動力。其作用途徑與調(diào)控腸神經(jīng)叢NOS1和P物質(zhì)陽性表達有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  結(jié)腸疾病， 功能性

　　結(jié)腸慢輸型便秘（slow transit constipation， STC）是由于胃腸道傳輸功能障礙所致的便秘，其相關(guān)發(fā)病因素眾多，但確切發(fā)病機制尚未明確。近年我科以恢復胃腸傳導功能為治療原則，將益氣開秘方應用于結(jié)腸慢輸型便秘的臨床治療，取得了滿意效果。本課題旨在通過動物實驗證實益氣開秘法對腸道運動的調(diào)節(jié)作用，并主要從腸道神經(jīng)肽P物質(zhì)（substance P， SP）和一氧化氮合酶1（nitric oxide synthase-1， NOS1）的角度探討其作用機制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 動物來源與品系 實驗用無特定病原體級（specific pathogen free， SPF）SD大鼠80只（中國科學院上海實驗動物中心提供），雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g.

　　1.1.2 藥物 益氣開秘方由生黃芪30 g、生白術(shù)15 g、枳殼12 g、杏仁12 g、生地黃15 g、火麻仁15 g組成，由龍華醫(yī)院制劑室按2000年版藥典要求，制備成水煎劑，約含生藥量2 g/ml. 根據(jù)《中藥藥理研究方法學》［1］計算出中藥人鼠等效劑量，2 ml/次， 2次/d 灌胃。西安楊森制藥廠生產(chǎn)的西沙必利（普瑞博思）為對照藥物，規(guī)格為5 mg/片。用生理鹽水溶解至約含藥量0.05 mg/ml，根據(jù)《中藥藥理研究方法學》［1］計算人鼠等效劑量，2 ml/次，2次/d灌胃。

　　1.1.3 實驗試劑與儀器 臺氏液（每1 000 ml中含NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、CaCl20.2 g、NaHCO31.0 g 、NaH2PO40.05 g、MgCl20.1 g、葡萄糖1.0 g）、武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的工作濃度均為1∶80的NOS1兔抗多克隆抗體和P物質(zhì)兔抗多克隆抗體、SABC型免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒和CW-3型平滑肌槽以及Olympus公司生產(chǎn)的AHBT-5B通用研究顯微鏡。

　　1.2 造模方法 參考文獻［2］用口服復方苯乙哌啶加酚酞的方法建立大鼠結(jié)腸慢輸型便秘模型。飼喂3個月造模成功后分組給藥。

　　1.3 動物分組及取材

　　1.3.1 動物分組 采用完全隨機方法分為模型組、西沙必利對照組和中藥組，另設正常對照組。每組各20只大鼠。分組當日起給藥，連續(xù)給藥4周后取 材。

　　1.3.2 取材 實驗前24 h將大鼠禁食不禁水。每組各取10只，實驗前1 h用100 g/L活性碳混懸液1 ml灌胃，灌胃1 h后脫頸處死，立即剖腹，取出從幽門到直腸末端的全部腸道，在松弛狀態(tài)下測量腸道的全長及活性碳在腸道內(nèi)推進的長度，計算推進百分率。每組另10只大鼠，動脈放血處死，腹正中切口進腹，快速于回盲部、升結(jié)腸及降結(jié)腸中部各取一段腸管，約2 cm長，置于臺式液（pH 6.6～6.8）平皿中沖洗干凈，縱行剖開腸管，剝?nèi)ヰつ?，去除附著的系膜或脂肪，放在充氧、保溫?7 ℃左右）的臺氏液中備用。在橫結(jié)腸部位取新鮮腸壁組織，放于10%中性甲醛固定液中，用于形態(tài)學觀察及免疫組化實驗。

　　1.4 觀察指標與方法

　　1.4.1 活性碳推進試驗檢測腸道傳輸功能 碳末推進百分率（%）=（碳末前端與幽門的距離/腸道全長）×100

　　1.4.2 離體腸肌條動力測定 將放在充氧、保溫（37 ℃左右）的臺氏液中的肌條，一端固定在CW-3型平滑肌槽下端的彎鉤，另一端固定于拉力換能器（量程10 g）。肌條放入含有持續(xù)充氧的臺氏液容器中，待自發(fā)活動穩(wěn)定后，描記正常曲線3 min，張力變化通過多道生理記錄儀記錄到微機，以Chart 4.0軟件分析記錄，統(tǒng)計肌條收縮的振幅及頻率。

　　1.4.3 免疫組化法檢測NOS1和P物質(zhì)的表達 免疫組化SABC法檢測NOS1和P物質(zhì)表達，具體方法按試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察，有棕黃染色者為NOS1和P物質(zhì)陽性。采用德國Leica（萊卡）全自動圖像分析系統(tǒng)，對各組免疫組化切片進行圖像分析。根據(jù)各組切片中的染色條件，在統(tǒng)一閾值下進行。在200倍顯微鏡下，每張切片隨機選取3個視野，測定各組在統(tǒng)一光度下陽性細胞的陽性面積百分比。

　　1.5 統(tǒng)計學方法 采用SSPS 11.5軟件，碳末推進百分率、腸管肌條收縮的振幅及頻率、NOS1和P物質(zhì)陽性細胞的積分光密度均采用方差分析的方法作組間差異的比較。

　　2 結(jié)果

　　2.1 腸道碳末推進試驗檢測碳末推進百分率 模型組較正常對照組明顯降低，中藥組和西沙比利組較模型組均明顯提高，中藥組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表1.

　　表1 各組碳末推進百分率的比較（略）

　　Table 1 Comparison of percentage of carbon propelling in 4 groups

　　*P <0.05 vs untreated group；△P <0.05 vs normal control group.

　　2.2 離體腸管肌條收縮活動 模型組各腸段腸管肌條收縮的頻率和振幅較正常對照組明顯降低。中藥組和西沙比利組與模型組比較，頻率和收縮振幅均有提高，差異有統(tǒng)計學意義。中藥組和西沙比利組的升結(jié)腸段腸管肌條收縮的頻率和振幅與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2和圖1.

　　表2 各組腸收縮頻率和振幅的比較（略）

　　Table 2 Comparison of contraction frequency and amplitude of the muscle segments in 4 groups

　　* P <0.05 vs untreated group；△P <0.05 vs normal control group.

　　圖1 升結(jié)腸平滑肌條收縮頻率及振幅（略）

　　Figure 1 Contraction frequency and amplitude of smooth muscle segment of ascending colon of the rats in 4 groups A： Normal control group； B： Untreated group； C： YQKMR treated-group； D： Cisapride treated-group.

　　2.3 結(jié)腸腸壁組織NOS1和P物質(zhì)表達 正常大鼠結(jié)腸腸壁組織內(nèi)P物質(zhì)陽性神經(jīng)元密集分布，胞體較大，而模型組P物質(zhì)陽性神經(jīng)元分布分散稀疏，胞體較小。正常對照組NOS1陽性神經(jīng)元分布稀疏，而模型組NOS1陽性神經(jīng)元分布明顯增多。圖像分析顯示NOS1陽性細胞面積百分比， 模型組較正常對照組、西沙必利組和中藥組明顯升高，中藥組NOS1陽性細胞面積百分比與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。P物質(zhì)陽性細胞面積百分比，模型組較正常對照組明顯下降，其中中藥組P物質(zhì)陽性細胞面積百分比與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。見表3、圖2和圖3.

　　表3 大鼠腸壁組織NOS1和P物質(zhì)陽性面積（略）

　　Table 3 Expressions of NOS1 and SP in colon wall tissue of the rats in 4 groups

　　*P <0.05 vs untreated group；△P <0.05 vs normal control group.

　　圖2 大鼠結(jié)腸組織NOS1陽性表達（SABC，10×10）（略）

　　Figure 2 Expression of NOS1 protein in colon wall tissue of the rats （SABC，10×10）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： YQKMR treated-group； D： Cisapride treated-group.

　　圖3 大鼠結(jié)腸組織P物質(zhì)陽性表達（SABC，10×20）（略）

　　Figure 3 Expression of SP in colon wall tissue of the rats （SABC，10×20）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： YQKMR treated-group； D： Cisapride treated-group.

　　3 討論

　　結(jié)腸慢輸型便秘屬中醫(yī)學“陰陽結(jié)”、“脾約”等范疇。我們根據(jù)中醫(yī)學“陰陽結(jié)”、“脾約”的理論認識并結(jié)合本單位便秘?？?0余年的臨床實踐，提出氣化不利、氣機郁滯和氣虛津虧是本病的病機。針對其病機，我們認為益氣開秘是恢復胃腸傳導功能的關(guān)鍵。補益中氣是直接動力，調(diào)暢氣機是間接動力。若氣得補養(yǎng)，以復其剛大之性，則沖突排蕩，開秘行滯。此外，通過補氣、升清降濁和蒸化津液可達補陰目的。益氣開秘方中以生黃芪和生白術(shù)為君藥，枳殼、杏仁理氣開秘以開上竅，通下竅，促進大腸傳導功能，少佐以生地以助濡養(yǎng)腸道。 碳末推進實驗顯示模型組碳末推進百分率較正常對照組明顯降低，中藥組和西沙比利組與模型組比較，碳末推進百分率均明顯提高，說明中藥有一定促進腸道動力作用。離體肌條收縮試驗顯示模型組肌條收縮頻率和振幅較正常對照組明顯下降，中藥組肌條收縮頻率和振幅與模型組比較均有明顯提高，其中對于升結(jié)腸段振幅的恢復最為明顯，與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。腸道動力是由多種神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體構(gòu)成的復雜神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡系統(tǒng)調(diào)控。其中一氧化氮（nitric oxide， NO）是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)叢內(nèi)的NOS1神經(jīng)元通過釋放NO而抑制結(jié)腸推 進性收縮。研究表明STC患者結(jié)腸壁肌間叢和黏膜下叢NOS1表達均增高，從而釋放大量的NO，導致結(jié)腸推進性收縮受抑制［3］。SP神經(jīng)元屬于肽能神經(jīng)元，SP是刺激腸道運動的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。STC患者結(jié)腸壁肌間神經(jīng)叢SP能神經(jīng)元減少或功能降低［4～6］。童衛(wèi)東等［7］應用NOS1和SP的兔多克隆抗體，對手術(shù)切除的15例STC患者和 11例 對照組乙狀結(jié)腸慢輸型便秘患者標本進行免疫組化染色和半定量分析，結(jié)果STC患者乙狀結(jié)腸肌間神經(jīng)叢NOS1免疫反應性明顯升高，而SP免疫反應性明顯降低。黏膜下神經(jīng)叢NOS1及SP免疫反應性與對照組的差異無統(tǒng)計學意義，認為STC結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)NOS1和SP免疫反應性的異常變化可能是其結(jié)腸傳輸減慢的神經(jīng)病理基礎。本實驗免疫組化結(jié)果顯示正常大鼠結(jié)腸腸壁組織內(nèi)SP陽性神經(jīng)元密集分布，胞體較大，而模型組SP陽性神經(jīng)元分布稀疏，胞體較小。正常對照組NOS1陽性神經(jīng)元分布稀疏，而模型組NOS1陽性神經(jīng)元分布較正常對照組明顯增多。研究結(jié)果表明本次實驗所采用的大鼠STC病理模型可以反映出NOS1和SP在STC發(fā)生過程中的病理變化。研究進一步顯示中藥組和西沙必利組NOS1陽性細胞面積百分比較模型組明顯降低，其中中藥組NOS1陽性表達與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；而中藥組和西沙必利組SP陽性細胞面積百分比較模型組均明顯升高，其中中藥組SP陽性表達與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果均表明益氣開秘方促進腸道動力的作用可能與上調(diào)SP的陽性表達和抑制NOS1的陽性表達有關(guān)，并通過調(diào)控腸道動力網(wǎng)絡中的興奮和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡來達到恢復腸道自然生理功能的目的。

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