【摘要】  通過乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）的檢測，觀察解毒通絡(luò)藥物干預(yù)后的腦微血管內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（ conditioned medium of cerebral microvascular endothelial cells， CMECs-CM）特征及其抗缺血及再灌皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的效應(yīng)，探討腦微血管內(nèi)皮細胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）調(diào)控神經(jīng)元功能的機制。方法：通絡(luò)救腦注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）作用于正常、缺血和缺血再灌三種培養(yǎng)狀態(tài)的大鼠CMECs，分別收集有藥物干預(yù)及無干預(yù)的三對無血清內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液，并測定其LDH值。同步原代培養(yǎng)大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元，亦分為正常、缺血、缺血再灌三組，用低（10%）、中（50%）、高（100%）三種濃度的各類CMECs-CM分別作用上述三種培養(yǎng)狀態(tài)的神經(jīng)元，測定其LDH漏出率。結(jié)果：比較TLJNI干預(yù)后的CMECs-CM與無干預(yù)的CMECs-CM中LDH漏出值，CMECs缺血組與缺血再灌組經(jīng)藥物干預(yù)后均明顯降低（ P <0.01）。對于缺血神經(jīng)元，缺血內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（conditioned medi-um of ischemic CMECs， Is-CM）高濃度（100%）和TLJNI干預(yù)后的缺血內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（conditioned medium of ischemic CMECs with drug treatment， IsT-CM）高濃度（100%）作用后表現(xiàn)為增加LDH漏出率（ P <0.01），而低濃度10%的IsT-CM則降低LDH漏出率（ P <0.05 ）；對于缺血再灌神經(jīng)元，與對照組比較，各類CMECs-CM作用后均能降低神經(jīng)元LDH漏出率（ P <0.05 或 P <0.01）。比較每種條件液相鄰濃度間的效應(yīng)差異，均以10%或50%的CM降低損傷為佳，正常內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（conditioned medium of normal CMECs， N-CM）及缺血再灌內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（conditioned medium of ischemic/reperfusional CMECs， Rp-CM）組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05或 P <0.01 ）；對于正常神經(jīng)元，各類CMECs-CM作用后均增加了神經(jīng)元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01 ）。比較每種條件液相鄰濃度間的效應(yīng)差異，N-CM組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05或 P <0.01 ）。結(jié)論：TLJNI能夠防御CMECs缺血及缺血再灌的損傷，可以通過內(nèi)皮細胞介導(dǎo)發(fā)揮抗缺血及缺血再灌神經(jīng)元損傷的效應(yīng)。提示CMECs-CM及TLJNI干預(yù)后的CMECs-CM均存在著抗缺血再灌神經(jīng)元損傷的活性物質(zhì)。

　　【關(guān)鍵詞】  腦微血管內(nèi)皮細胞； 神經(jīng)元； 腦缺血； 大鼠； 中藥

　　近年來中藥調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮的研究日益受到人們的重視［1～3］，但整體動物實驗無法將內(nèi)皮細胞與腦細胞分離開來進行研究，本實驗室采用大鼠大腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元分離純化培養(yǎng)的方法，可使其純度分別達到98%，是研究二者之間關(guān)系的一種可靠的實驗方法。通絡(luò)救腦注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）是治療缺血性腦病的中藥新藥。初步實驗證實，TNJNI在缺血內(nèi)皮細胞損傷狀態(tài)下具有可靠的維護腦微血管內(nèi)皮功能的作用［4，5］。這種對腦微血管內(nèi)皮細胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）的保護作用是否啟動進一步的腦保護效應(yīng)有待探知。本實驗通過觀察CMECs缺血損傷及通絡(luò)救腦注射液干預(yù)后的不同條件培養(yǎng)液（conditioned medium， CM）抗缺血神經(jīng)元損傷的效應(yīng)，探討CMECs與神經(jīng)元的功能聯(lián)系，并進一步闡明通絡(luò)救腦注射液的“解毒通絡(luò)”作用機制，對于深化“毒損腦絡(luò)”病機［6］的生物學(xué)理論內(nèi)涵具有重要意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　1.1.1 動物 雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量 60～80 g ，用于同一批CMECs原代培養(yǎng)。新生SD大鼠（24 h內(nèi)）4只，用于同一批原代神經(jīng)元培養(yǎng)。動物合格證號為SCXK京2002-0003，清潔級，購自北京維通利華實驗動物中心。

　　1.1.2 藥物 通絡(luò)救腦注射液，批號為04061011，購自內(nèi)蒙古康源藥業(yè)有限公司。 藥物組成為梔子和三七，提取分離有效成分梔子苷和三七總皂苷，配伍制成注射液，該注射液含原藥有效成份為 7.7 mg/ml.

　　1.2 實驗方法 通過乳酸脫氫酶（lactate dehydro-genase， LDH）的檢測，觀察正常、缺血及缺血再灌不同狀態(tài)的腦微血管內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（condi-tioned medium of cerebral microvascular endotheli-al cells， CMECs-CM）和 TLJNI干預(yù)后的CMECs-CM抗缺血及缺血再灌皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的特征效應(yīng)。

　　1.2.1 解毒通絡(luò)藥物干預(yù)后的CMECs-CM的收集

　　1.2.1.1 CMECs的培養(yǎng) 雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量60～80 g，用于同一批CMECs原代培養(yǎng)。無菌條件下取出雙側(cè)大腦半球，置預(yù)冷的沖洗液（DMEM培養(yǎng)液，10%新生牛血清、青霉素 1×105U/L ，鏈霉素1×10 5U/L）中，剔除軟腦膜、表面血管及白質(zhì)，收集皮質(zhì)。剪碎成1 mm 3的小塊，置手動玻璃勻漿器，冰上操作上下勻漿約25次。依次通過80目和200目尼龍網(wǎng)過濾，收集200目濾網(wǎng)上微血管段。用0.1%膠原酶，37 ℃消化30 min.沖洗液沖洗兩遍，1 000 r/min（RCF：201× g ）離心 5 min ，將微血管段重懸于完全培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清20%；內(nèi)皮細胞生長支持物（endotheli-al cells growth support， ECGS）75 mg/L、肝素鈉 4× 10 4U/L、青霉素1×105U/L、鏈霉素 1×105U/L 、胰島素200 U/L、 L -谷氨酰胺 2 mmol/L 中，接種于2%明膠預(yù)先包被的25 cm 2培養(yǎng)瓶（Costar公司）中，共3瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h后，第1次換液。第7天細胞基本融合成片，進行消化傳代，消化液為體積比為1∶1的 0.125% 的胰蛋白酶與0.02% EDTA.

　　二代經(jīng)過Ⅷ因子免疫熒光鑒定，其純度可達98%.培養(yǎng)的第二代CMECs 90%匯合后經(jīng)消化后再傳代，傳到25 cm2培養(yǎng)瓶共12瓶。本實驗用第三代細胞，將實驗細胞分為正常、缺血（ischemia， Is）和缺血再灌（ischemia/reperfusion， I/R）三組各4瓶，每組又分為2瓶加TLJNI藥物干預(yù)，2瓶無藥物干預(yù)，用以收集CMECs-CM.

　　1.2.1.2 條件培養(yǎng)液的收集 CMECs隨機分為正常、缺血和缺血再灌三組，分別收集解毒通絡(luò)藥物干預(yù)及無干預(yù)的三對無血清CMECs-CM.解毒通絡(luò)干預(yù)藥物為通絡(luò)救腦注射液。給藥方式采用容積單位為計算單位，根據(jù)預(yù)實驗確定給藥的終濃度劑量為40 μl/ml，設(shè)計藥物作用時間是12 h.各樣本均收集了10 ml條件液，分裝1 ml eppendorf管，置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩ＵMECs條件培養(yǎng)液（conditioned medium of normal CMECs， N-CM）及藥物干預(yù)的正常條件培養(yǎng)液（conditioned medium of normal CMECs with drug treatment， NT-CM）收集：正常培養(yǎng)的CMECs及TLJNI干預(yù)12 h后的CMECs棄去完全培養(yǎng)液，D-Hank‘s沖洗兩遍，換上無血清DMEM培養(yǎng)液， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 12 h .收集DMEM培養(yǎng)液，4 ℃、2 500 r/min（RCF：1 258× g ）離心20 min，取上清即N-CM及NT-CM.缺血內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（conditioned medi-um of ischemic CMECs， Is-CM）及TLJNI干預(yù)的缺血條件培養(yǎng)液（conditioned medium of ischemic CMECs with drug treatment， IsT-CM）收集：采用氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation， OGD）法模擬在體缺血，藥物干預(yù)組造模前預(yù)用藥 6 h ，方法同正常干預(yù)組。造模時棄去完全培養(yǎng)液，以D-Hank’s 沖洗細胞兩遍，換Kreb‘s溶液（NaCl 119 mmol/L 、 KCl 4.7 mmol/L、KH 2PO41.2 mmol/L 、NaHCO325 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、MgCl21 mmol/L ）；藥物干預(yù)組換上含藥的Kreb’s液。置37 ℃、93% N2+7% CO2自制的密閉缺氧罐中培養(yǎng)6 h.收集Kreb‘s培養(yǎng)液，4 ℃、2 500 r/min（RCF：1 258× g ）離心20 min，取上清即Is-CM及 IsT-CM .

　　缺血再灌內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液（conditioned mediumof ischemic/reperfusional CMECs， Rp-CM） 及TLJNI干預(yù)的缺血再灌條件培養(yǎng)液（conditioned medium of ischemic/reperfusional CMECs with drug treatment， RpT-CM）收集：缺血模型及藥物干預(yù)同上，氧糖剝奪6 h后棄去Kreb‘s培養(yǎng)液，換上無血清DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)再灌12 h，收集DMEM培養(yǎng)液， 4 ℃ 、 2 500 r/min（RCF：1 258× g ）離心20 min，取上清即Rp-CM及RpT-CM.

　　1.2.2 皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 無菌分離新生SD大鼠的大腦皮層，經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，懸于接種培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)液含10%馬血清、10%胎牛血清、青霉素 1×105U/L、 鏈霉素1×105U/L）中，以1×109/L的細胞密度接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。置 37 ℃ 、5% CO 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后換維持液（DMEM培養(yǎng)液、10%馬血清、1%N3、青霉素 1×105U/L、 鏈霉素1×105U/L）。當(dāng)細胞培養(yǎng)到第 3天 時加阿糖胞苷（10 -5mol/L），并持續(xù)作用72 h以抑制非神經(jīng)細胞的增殖。之后換全液以去除阿糖胞苷的作用，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d用于實驗。

　　1.2.3 各類CMECs-CM分別作用正常、缺血及缺血再灌三組神經(jīng)元 神經(jīng)元細胞隨機分為正常、缺血、缺血再灌三組，缺血模型及缺血再灌方法同CMECs.各類CMECs-CM均設(shè)低、中、高三種濃度分別誘導(dǎo)各組神經(jīng)元。（1）對于正常組，棄去完全培養(yǎng)液，D-Hank‘s沖洗兩遍，將收集的N-CM、 NT-CM 及Rp-CM、RpT-CM按0（即正常神經(jīng)元對照組）、10%、50%和100%的濃度加入實驗各孔（每個濃度做6個重復(fù)孔，即每孔加CM 0、10、50和 100 μl ，下同），余用DMEM培養(yǎng)液補足至100 μl.37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，之后檢測LDH漏出率。（2）對于缺血組，將收集的Is-CM及IsT-CM按0（即缺血神經(jīng)元對照組）、10%、50%和100%的濃度加入實驗各孔之中，余用Kreb’s液補足至100 μl；另外還設(shè)立一組TLJNI（ 40 μl/ml ）直接作用缺氧神經(jīng)元。置37 ℃、93% N2+7% CO2自制的密閉缺氧罐中培養(yǎng)6 h，之后檢測LDH漏出率。（3）對于缺血再灌組，缺血模型同Is組，氧糖剝奪6 h后棄去Kreb‘s液，之后同正常組。將收集的N-CM、 NT-CM 及Rp-CM、RpT-CM按0（即缺血再灌神經(jīng)元對照組）、10%、50%和100%的濃度加入實驗各孔之中，余用DMEM培養(yǎng)液補足至100 μl.37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)再灌12 h，之后檢測LDH漏出率。1.2.4 神經(jīng)元細胞LDH漏出率測定 LDH試劑盒購自Promega公司，具體步驟參照說明書，終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀測定492 nm光密度值（optical density， OD）。測量內(nèi)容包括：（1）將標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋成不同濃度梯度，繪制出LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）測定CMECs-CM（N-CM、NT-CM、Is-CM、IsT-CM、Rp-CM、RpT-CM）中LDH含量（DMEM液和Kreb’s液調(diào)零），一方面可了解CMECs各組CM中LDH的漏出情況，另一方面可用于校正神經(jīng)元培養(yǎng)液上清的實際LDH值。（3）一一對應(yīng)測定神經(jīng)元培養(yǎng)液上清及細胞完全裂解后的LDH值。神經(jīng)元培養(yǎng)液上清LDH的實際漏出值=測定值-校正值。神經(jīng)元LDH的漏出率（%）=［培養(yǎng)液上清LDH值/（培養(yǎng)液上清LDH值+細胞裂解后LDH值）］×100.

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)以 x ± s 表示，行單因素方差分析。

　　2 結(jié)果

　　2.1 CMECs各組條件培養(yǎng)液中LDH的測定 圖1示LDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。因試劑盒未提供陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，所以橫坐標(biāo)LDH的含量為標(biāo)準(zhǔn)品的體 積含量。縱坐標(biāo)OD值在0～5之間即跨度很大范圍內(nèi)都與LDH的含量呈良好的線性關(guān)系，提示本實驗方法穩(wěn)定、統(tǒng)計可信。

　　圖1 LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（略）

　　Figure 1 Standard curve of lactate dehydrogenase

　　通過對各組的LDH測定，可以了解CMECs各組CM中LDH的漏出情況。比較TLJNI干預(yù)后的CMECs-CM與無干預(yù)的CMECs-CM，缺血組與缺血再灌組藥物干預(yù)后LDH漏出值均明顯降低（ P <0.05）；正常組藥物干預(yù)后LDH漏出值略增高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。說明TLJNI能夠防御CMECs缺血及缺血再灌的損傷。見表1.正常、缺血及缺血再灌組組間比較，缺血組LDH漏出最低，缺血組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）；缺血再灌組漏出最高，與缺血組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01），提示CMECs缺血及再灌模型基本可靠。缺血組LDH漏出最低可能與其CM收集的時間有關(guān)，因其造模時間是6 h，故收集的是6 h的培養(yǎng)液，而正常及缺血再灌組收集的是12 h的條件培養(yǎng)液。見表1.

　　表1 TLJNI干預(yù)與未干預(yù)的各組CMECs-CM的LDH釋放值比較（略）

　　Table 1 LDH release value of different CMECs-CM

　　* P <0.05， vs CM without drug treatment；△△P <0.01， vs normal CMECs-CM；▲▲P <0.01， vs ischemia CMECs-CM.

　　2.2 不同CMECs-CM分別作用不同狀態(tài)神經(jīng)元后的LDH漏出率 Is-CM不同濃度作用缺血神經(jīng)元，與對照組即未做任何處理的缺氧神經(jīng)元比較，僅表現(xiàn)為100%的Is-CM增加LDH漏出率（ P < 0.01 ）。IsT-CM作用后表現(xiàn)為100%的IsT-CM增加LDH漏出率（ P <0.01），而10%的IsT-CM組 降低LDH漏出率（ P <0.05）。不同濃度及組別的CM作用規(guī)律不一致，可能與所含活性物質(zhì)不同，或所含活性因子的不同效價有關(guān)。見表2.TLJNI直接干預(yù)神經(jīng)元，與對照組比較，LDH漏出率卻明顯增高（ P <0.01），可能與本實驗的投藥劑量（僅參照CMECs的給藥方式）偏高有關(guān)。若CMECs-CM作用Is組神經(jīng)元與藥物直接作用組比較，則均表現(xiàn)為LDH漏出率降低（ P < 0.05 或 P <0.01），提示藥物可通過內(nèi)皮細胞介導(dǎo)發(fā)揮抗缺血神經(jīng)元損傷的作用。見表2.

　　表2 CMECs-CM對缺血神經(jīng)元LDH漏出率的影響（略）

　　Table 2 LDH leakage rate of ischemia neurons intervened by different CMECs-CM

　　*P <0.05，**P <0.01， vs untreated control group；△P <0.05 ，△△P <0.01， vs drug-treated group.

　　與對照組比較，各類CMECs-CM作用缺血再灌組神經(jīng)元后均能降低神經(jīng)元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01），提示各類CMECs-CM都存在著抗再灌神經(jīng)元損傷的活性物質(zhì)。每種條件液相鄰濃度間比較，均以10%或50%的CM降低損傷為佳，N-CM及Rp-CM組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P < 0.05 或 P <0.01），其余兩組濃度間差異不顯著，提示不同組間發(fā)揮作用的活性物質(zhì)的不一致性及可能非單一活性物質(zhì)作用的復(fù)雜性。見表3.

　　表3 CMECs-CM對正常組及缺血再灌組神經(jīng)元 LDH漏出率的影響（略）

　　Table 3 LDH leakage rates of normal and ischemia/ reperfusion neurons intervened by different CMECs-CM

　　*P <0.05，**P <0.01， vs control without CM group；△P <0.05 ，△△P <0.01， vs the nearest pre-concentration group.

　　各類CMECs-CM作用于正常組神經(jīng)元后均增加了神經(jīng)元LDH漏出率（ P <0.05或 P <0.01）。每種條件液相鄰濃度間比較，N-CM三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05或 P <0.01），其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3.

　　3 討論

　　我們從以往的離體實驗已知，TLJNI在缺血狀態(tài)下具有可靠的維護腦微血管內(nèi)皮功能的作用［4，5］，對于改善腦微灌流具有實際意義。這種對CMECs的保護作用是否啟動進一步的腦保護效應(yīng)有待探知。目前對中藥保護腦缺血損傷的研究，多針對藥物能否透過血腦屏障這一關(guān)鍵途徑而開展，本實驗收集了正常、缺血及解毒通絡(luò)藥物干預(yù)的各種無血清內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液，試圖了解生理及病理狀態(tài)下可能通過內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的對神經(jīng)元發(fā)揮作用的途徑和效應(yīng)。結(jié)果表明對于缺血及再灌這種病理狀態(tài)下的神經(jīng)元，各類CMECs-CM都起到了一定的抗損傷效應(yīng)。理論上假說應(yīng)是不同類別的條件培養(yǎng)液對神經(jīng)元的作用機制有著差別，可以預(yù)想各類條件培養(yǎng)液中分別蘊含著多種活性物質(zhì)，我們更感興趣的是所涉及的功能蛋白質(zhì)是如何發(fā)揮作用。發(fā)揮作用的生物活性因子可能是一種或是多種，與條件培養(yǎng)液收集的時段有關(guān)。探索其作用機制還要考慮到動態(tài)變化諸如激活、失活、協(xié)同、拮抗、連鎖等諸多因素的影響。本實驗僅從細胞的LDH漏出率角度即代表著細胞膜損害的一個指標(biāo)揭示了初步現(xiàn)象，表明TLJNI可通過內(nèi)皮細胞介導(dǎo)發(fā)揮抗缺血神經(jīng)元損傷的作用，提示各類CMECs-CM都存在著抗缺血及缺血再灌神經(jīng)元損傷的活性物質(zhì)。但該時段的內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液對正常神經(jīng)元卻表現(xiàn)為增加了LDH漏出率，即一定程度上增加了細胞膜損傷。我們知道腦微血管內(nèi)皮及其緊密連接是血腦屏障的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。正常情況下，除氧和二氧化碳可以自由通過血腦屏障外，絕大多數(shù)物質(zhì)通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有其特定的通道。血腦屏障選擇性控制腦細胞間液與血液間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，維持腦細胞間液的平衡，從而保證了神經(jīng)細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。體外研究內(nèi)皮細胞分泌的活性物質(zhì)直接作用于神經(jīng)細胞，暫時忽略了血腦屏障選擇性的屏障保護作用，可能是導(dǎo)致正常神經(jīng)元細胞膜通透性增加的主要原因。但仍為我們進一步深入研究內(nèi)皮細胞的合成和分泌功能，及其活性物質(zhì)調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞功能的作用機制，提供了積極的啟示。腦缺血損傷是眾多腦系疾病的共同病理過程，闡明疾病的分子和細胞機制及藥物作用的靶標(biāo)，發(fā)展尋找新藥的新理論、新技術(shù)、新方法［7］，相信會為治療腦系疾病的中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路。研究報道內(nèi)皮細胞具有強大的分泌功能［8］，探索已知的、未知的、好的、壞的腦微血管內(nèi)皮細胞的調(diào)控機制具有重要意義。就中醫(yī)而言，以毒邪和絡(luò)病作為深入研究的切入點，是進一步提高腦血管疾病療效的突破口所在［9］。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者已注意到微循環(huán)局部與整體全過程的聯(lián)系，提出血管內(nèi)皮細胞是某些致病因素的靶細胞［10，11］。我們以CMECS為切入點，詮釋TLJNI“解毒通絡(luò)”的作用機制，探索藥物的有效“靶標(biāo)”分子，對于深化“毒損腦絡(luò)”病機［6］理論內(nèi)涵具有重要意義。

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　　4 Qing XM， Li WH， Hou JC， et al. Effects of Tongluoji-unao injection on the activity of rat cerebral microvascu-lar endothelial cells. Xian Dai Sheng Wu Yi Xue Jin Zhan. 2006； 6（2）： 12， 15-18. Chinese with abstract in English. 青雪梅， 李衛(wèi)紅， 侯金才， 等。 通絡(luò)救腦注射液對腦微血管內(nèi)皮細胞活性影響的特征。 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展。 2006； 6（2）： 12， 15-18.

　　5 Qing XM， Li PT， Hu JH， et al. Observing effects of TLJN injection on the rat cerebral microvascular endo-thelial cells and primary study of the feature of cellular conditioned medium. Xian Dai Sheng Wu Yi Xue Jin Zhan. 2006； 6（4）： 1-4. Chinese with abstract in Eng-lish.青雪梅， 李澎濤， 胡京紅， 等。 通絡(luò)救腦注射液對大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞活性及其條件培養(yǎng)液影響的初步研究。 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展。 2006； 6（4）： 1-4.

　　6 Li PT， Wang YY， Huang QF. The hypothesis of the injury of brain collaterals by toxins and its theoretical and practical significance. Beijing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 2001； 24（1）： 1-6， 16. Chinese with abstract in English.李澎濤， 王永炎， 黃啟福。 “毒損腦絡(luò)”病機假說的形成及其理論與實踐意義。 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報。 2001； 24（1）： 1-6， 16.

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　　9 Wang YY. Thinking of the difficult points of improving therapeutic effects on cerebrovascular diseases. Zhong-guo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1997； 17（4）： 195-196. Chinese.王永炎。 關(guān)于提高腦血管疾病療效難點的思考。 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志。 1997； 17（4）： 195-196.

　　10 Lei Y， Wang YY， Huang QF. Discussion on the collat-eral disease doctrine. Beijing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 1998； 21（2）： 18-23， 72. Chinese with abstract in English.雷燕， 王永炎， 黃啟福。 絡(luò)病理論探微。 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報。 1998； 21（2）： 18-23， 72.

　　11 Luscher TF， Tanner FC， Tschudi MR， et al. Endothe-lial dysfunction in coronary artery disease. Annu Rev Med. 1993； 44： 395-418.