骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦血管病的研究進(jìn)展

2007-07-24 14:16 來(lái)源：

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　　1992年Reynolds等［1］首次從成年鼠紋狀體中分離出神經(jīng)干細(xì)胞，從而打破了神經(jīng)損傷不可修復(fù)的觀點(diǎn)，有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞的研究已成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞移植曾一度為缺血性腦損傷的治療開(kāi)辟了一條新的途徑，但由于兩者來(lái)源主要有克隆和胚胎兩個(gè)方面，方法復(fù)雜，涉及倫理問(wèn)題，臨床應(yīng)用受限。最近，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）橫向分化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)以及其易獲得性又使人們對(duì)干細(xì)胞移植在腦血管病方面的治療前景充滿信心?，F(xiàn)就近年來(lái)有關(guān)BMSC治療缺血性腦血管病的基礎(chǔ)與臨床研究綜述如下。

　　1 BMSC的生物學(xué)特點(diǎn)

　　Friedenstein等［2］首先從骨髓中分離到BMSC，他們將整個(gè)骨髓放置于塑料培養(yǎng)皿中，在去除非貼壁細(xì)胞后，觀察到呈紡錘狀的貼壁細(xì)胞，并形成2~4個(gè)細(xì)胞的小灶，最初量少，呈集落生長(zhǎng)，數(shù)天后開(kāi)始迅速分裂，大量增殖呈片狀融合，經(jīng)傳代培養(yǎng)后這些細(xì)胞成為均一的梭形，這些細(xì)胞集落成BMSC.BMSC可隨外周微環(huán)境的變化而分化為多種間充質(zhì)組織，如骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱及纖維組織等［3］。最近研究［4］發(fā)現(xiàn)BMSC除了分化為間充質(zhì)細(xì)胞譜系外，還具有向非間充質(zhì)細(xì)胞譜系如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞分化的多向分化潛能。BMSC在骨髓中含量較少，并且隨著年齡增長(zhǎng)遞減。采用免疫組化染色及流式細(xì)胞儀研究表明BMSC表達(dá)多種表面抗原標(biāo)志如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124等［3］，而不表達(dá)造血系統(tǒng)特征性標(biāo)志CD31、CD34、 CD45、CD117和CD133，證明BMSC與造血系統(tǒng)不是一類細(xì)胞［5］。迄今尚未找到BMSC特異性抗原標(biāo)記，鑒定BMSC目前主要依賴其形態(tài)水平，比較公認(rèn)的相對(duì)特異性的BMSC抗原標(biāo)記物是CD90、CD71及CD44.BMSC具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，即增殖、分化和自我更新的能力，取材方便、擴(kuò)增迅速、易體外培養(yǎng)；可取材于自身，不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，也無(wú)倫理道德問(wèn)題。將表達(dá)綠色熒光蛋白的BMSC經(jīng)靜脈注入小鼠后可以通過(guò)血腦屏障，遷移到腦實(shí)質(zhì)不同區(qū)域并表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物iba1，為BMSC移植應(yīng)用于腦缺血性疾病的治療提供了可能［6］。

　　2 BMSC治療缺血性腦損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

　　BMSC移植對(duì)腦缺血性疾病的治療作用在不同的實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)。Li等［7］將人BMSC經(jīng)尾靜脈移植給缺血1 d的短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型大鼠，結(jié)果人BMSC并未誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生明顯的免疫排斥反應(yīng)，移植后第14 d，與對(duì)照組（未給予BMSC或給予大鼠肝結(jié)締組織細(xì)胞移植）相比，靜脈移植人BMSC大鼠的神經(jīng)功能顯著改善，移植的BMSC中有1%～5%表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)記；采用ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）顯著增加；用TUNEL染色可見(jiàn)缺血邊緣區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)減少，缺血大腦半球腦室下區(qū)BrdU （5溴尿嘧啶）陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加。BMSC對(duì)MCAO大鼠發(fā)揮治療作用是通過(guò)多種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的，主要包括缺血區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTF）分泌增加、缺血半暗帶凋亡細(xì)胞減少和腦室下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖等。Shen等［8］將雄性大鼠來(lái)源的BMSC靜脈移植給缺血1個(gè)月的短暫性MCAO雌性大鼠，移植后3個(gè)月處死，與未治療的對(duì)照組相比，BMSC組改良神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善，原位雜交顯示BMSC主要存活于缺血同側(cè)大腦半球，Y染色體陽(yáng)性的細(xì)胞中13%表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）（星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物），6%表達(dá)微管相關(guān)蛋白2（MAP2）（神經(jīng)元的標(biāo)志物）。Chen等［9］對(duì)MCAO大鼠模型在大腦中動(dòng)脈閉塞24 h及7 d后尾靜脈移植BrdU標(biāo)記的BMSC，分別于14 d和35 d后處死，結(jié)果觀察到BMSC治療組大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及平衡能力獲得顯著改善；BMSC可在缺血大腦半球存活及集聚，部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白如MAP2、NeuN、GFAP等。Kurozumi等［10］將BDNF 基因修飾的BMSC植入MCAO的Wistar大鼠模型，在術(shù)后第7 d和第14 d MRI掃描發(fā)現(xiàn)腦梗死體積比對(duì)照組顯著縮小，神經(jīng)功能的缺損明顯改善。

　　3 BMSC治療腦外缺血性病變的臨床研究

　　BMSC對(duì)腦外缺血性病變的研究主要在動(dòng)物模型上進(jìn)行，其對(duì)缺血性腦損傷的臨床研究目前鮮見(jiàn)。但已有學(xué)者開(kāi)展了BMSC對(duì)周圍血管病及缺血性心臟病的臨床研究。Kim等［11］采用自體BMSC移植治療血栓閉塞性脈管炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分患者患肢側(cè)支循環(huán)血管增生，血液供應(yīng)增加，肢體功能獲得明顯改善。TateishiYuyama等［12］通過(guò)對(duì)周圍血管病變患者患肢腓腸肌注射BMSC，肯定了自體移植BMSC的有效性和安全性，并指出自體移植的BMSC能向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化并分泌一些促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子。Tse等［13］對(duì)8例嚴(yán)重的缺血性心臟病患者經(jīng)皮導(dǎo)管心肌內(nèi)植入自體BMSC，3個(gè)月后患者臨床癥狀明顯緩解，缺血區(qū)域血流灌注和功能得到改善。

　　4 BMSC治療腦缺血性疾病的作用機(jī)制

　　4.1 BMSC的分化 BMSC可分化為神經(jīng)細(xì)胞、替代損傷細(xì)胞、重建神經(jīng)環(huán)路，從而達(dá)到恢復(fù)神經(jīng)功能的目的。BMSC含有一些多分化潛能的間充質(zhì)祖細(xì)胞，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。使用BMSC修復(fù)神經(jīng)組織、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)關(guān)鍵在于誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。已有眾多學(xué)者報(bào)道BMSC在體內(nèi)外可分化成為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

　　4.1.1 體內(nèi)分化成為神經(jīng)細(xì)胞有研究［14］顯示腦梗死區(qū)特殊的微環(huán)境有利于BDNF、GDNF、NGF等NTF的表達(dá)，這些NTF不但是內(nèi)源性干細(xì)胞分化信號(hào)分子，也是BMSC分化成神經(jīng)細(xì)胞所必需的。Lu 等［15］報(bào)道將BrdU標(biāo)記的BMSC通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈注入外傷性腦損傷大鼠模型，細(xì)胞治療7 d后采用免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)BMSC可通過(guò)血腦屏障向病變部位遷移，并對(duì)微環(huán)境中的一些信號(hào)作出反應(yīng)，表達(dá)MAP2、NeuN和GFAP等神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性抗原蛋白。馮大雄等［16］對(duì)脊髓損傷7 d動(dòng)物模型靜脈移植BMSC，移植后2周，BMSC形態(tài)大多變?yōu)閳A形或橢圓形，約126%表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP，約5.4%表達(dá)神經(jīng)元特異性核蛋白（NeuN）。

　　4.1.2 體外分化成為神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)BMSC在體外分化成為神經(jīng)細(xì)胞，目前采用的方法有兩種，即用抗氧化劑［17］和NTF ［18］。Woodbury等［17］報(bào)道抗氧化劑能迅速誘導(dǎo)BMSC分化成神經(jīng)細(xì)胞，將成年大鼠和人的BMSC先在含β巰基乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，隨后在含丁羥基苯甲醚、二甲亞砜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，60 min內(nèi)BMSC即有神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變，1周之內(nèi)，超過(guò)50%的BMSC出現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變，并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、NeuN 、NFM或tau.盡管抗氧化劑誘導(dǎo)效率高、起效快，但卻具有細(xì)胞毒性作用，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，細(xì)胞骨架改變［4］。SanchezRamos等［18］發(fā)現(xiàn)BMSC在含有表皮生長(zhǎng)因子（EGF）或BDNF的培養(yǎng)體系誘導(dǎo)7～14 d，發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記物nestin及神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物NeuN、GFAP的表達(dá)；BMSC與中腦或紋狀體細(xì)胞共同培養(yǎng)后部分細(xì)胞也會(huì)分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)NeuN和GFAP.Gao 等［19］研究發(fā)現(xiàn)BMSC可被誘導(dǎo)分化成腸道神經(jīng)元并表達(dá)腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，產(chǎn)生GDNF 及NGF，故提出BMSC 可作為一種新的方法治療神經(jīng)性胃腸蠕動(dòng)失調(diào)癥。

　　4.2 NTF的作用腦缺血可引起NTF的分泌增加［20］，而B(niǎo)MSC 的植入會(huì)明顯提高多種NTF的分泌。研究［21］發(fā)現(xiàn)BMSC可分泌NTF，如BDNF、NGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等。Chen等［21］將人BMSC培養(yǎng)在含有鼠腦抽提物的培養(yǎng)基中，采用ELISA方法發(fā)現(xiàn)BDNF、NGF、VEGF、HGF分泌呈時(shí)間依賴性增加，這些NTF能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用和支持新生血管形成。在腦缺血后移植進(jìn)入腦內(nèi)的BMSC釋放這些NTF對(duì)腦卒中動(dòng)物功能的恢復(fù)具有重要作用，從而達(dá)到治療目的。NTF又產(chǎn)生有利于BMSC自身存活、分化的微環(huán)境，可以促進(jìn)BMSC向神經(jīng)元分化。這就提示BMSC可能通過(guò)自分泌或者旁分泌NTF以及與外源性NTF協(xié)同發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

　　4.3 促進(jìn)血管生成、改善局部血液供應(yīng) 血管新生與功能恢復(fù)有關(guān)，因?yàn)檠苄纬墒钦＝M織修復(fù)中不可缺少的過(guò)程。缺血本身可以促進(jìn)血管新生［5］，但是僅僅依靠自身有限的血管新生還不足以使受損的缺血組織恢復(fù)血液供應(yīng)以達(dá)到功能恢復(fù)的需要。王春雪等［22］采用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（ rhGMCSF）在體外誘導(dǎo)BMSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并將誘導(dǎo)分化后的內(nèi)皮細(xì)胞靜脈移植MCAO大鼠模型后，大鼠神經(jīng)功能得到改善，同時(shí)觀察到VEGF及其受體的表達(dá)上調(diào)。Chen等［23］將人BMSC靜脈移植入腦缺血大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)大鼠缺血周邊區(qū)域新生血管生成，同時(shí)VEGF的分泌和VEGF receptor2的表達(dá)增加，提示BMSC可能通過(guò)促進(jìn)新生血管生成改善神經(jīng)功能。

　　4.4 刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化在有損傷的局部環(huán)境信號(hào)變化的刺激下，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)代償性增殖、分化。曾有學(xué)者嘗試在神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部應(yīng)用某些激活因子，以激活存在于損傷局部的神經(jīng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)其增殖、分化、整合，從而完成對(duì)損傷或變性的修復(fù)。Fallon等［24］已觀察到在動(dòng)物腦內(nèi)應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（TGFα）可迅速促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖并向注射TGFα的局部遷移，隨后分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。但刺激自身神經(jīng)干細(xì)胞的增殖較神經(jīng)干細(xì)胞移植更為困難，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞的增殖和定向分化需要多種生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。BMSC移植可能為缺血損傷的腦組織提供一些促分化因子，促進(jìn)宿主腦組織內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化和成熟，生成新的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，修復(fù)受損腦組織，促進(jìn)神經(jīng)功能的改善［7］。

　　4.5 抗凋亡作用腦缺血損傷發(fā)生后，缺血中央?yún)^(qū)神經(jīng)元壞死，而周邊區(qū)則發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡。如何能及時(shí)挽救缺血周邊區(qū)即半暗帶的細(xì)胞，改善局部血供，減少細(xì)胞的凋亡，是減輕腦缺血損傷的最終目標(biāo)。Li等［7］將人BMSC經(jīng)尾靜脈移植給MCAO大鼠，與對(duì)照組相比神經(jīng)功能缺損得到明顯改善，采用TUNEL和HE染色可見(jiàn)缺血邊緣區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)減少。Kurozumi等［10］將BDNF 基因修飾的BMSC植入MCAO的Wistar大鼠模型，免疫組織化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)缺血周邊區(qū)域凋亡細(xì)胞顯著少于對(duì)照組。上述研究說(shuō)明BMSC移植治療腦缺血損傷能減少細(xì)胞的凋亡，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

　　5 展望

　　BMSC具有多能干細(xì)胞的特點(diǎn)，可向多個(gè)方向分化，取材方便，而且植入體內(nèi)能保持細(xì)胞活性，被認(rèn)為是理想的組織工程種子細(xì)胞［3］。因此，可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞基因工程治療的有良好發(fā)展前景的載體。雖然對(duì)BMSC的研究取得了令人矚目的成果，但目前大部分僅停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，真正進(jìn)入臨床應(yīng)用還存在很多困難需要克服，如BMSC移植入腦內(nèi)的最佳方式，患者能否接受；BMSC移植治療的時(shí)機(jī)和劑量；是什么信號(hào)誘導(dǎo)BMSC到達(dá)缺血損傷區(qū)；BMSC在腦內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制；細(xì)胞移植后能否整合入宿主的神經(jīng)環(huán)路；這些問(wèn)題均有待于進(jìn)一步的研究。

　　基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生廳“135工程”重點(diǎn)人才基金資助

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