【摘要】  目的：探討慢性腎衰患者高瘦素血癥與瘦素基因表達(dá)及蛋白表達(dá)、腎小球濾過率、體質(zhì)指數(shù)及炎癥、空腹胰島素之間的相關(guān)性。 方法：檢測150例分別處于不同慢性腎功能衰竭階段患者的血清瘦素水平、腎小球濾過率、同型半胱氨酸、C反應(yīng)蛋白、空腹胰島素的，并計算其體質(zhì)指數(shù)。 RTPCR法檢測15例終末期腎衰患者腹部脂肪組織瘦素基因表達(dá)；免疫組化法檢測其瘦素蛋白表達(dá)。 結(jié)果：腎功能損傷患者血清平均瘦素水平明顯高于健康對照組（P<0.01），與體質(zhì)量指數(shù)之間呈正相關(guān)（P<0.01），與腎小球濾過率呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清瘦素與C反應(yīng)蛋白、同型半胱氨酸及空腹胰島素之間呈正相關(guān)（P均<0.05）。 終末期腎功能衰竭患者脂肪組織瘦素mRNA表達(dá)水平低于健康對照組（P<0.01），而蛋白表達(dá)高于健康對照組（P<0.01）。 血清瘦素水平與瘦素基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論：慢性腎衰患者血清瘦素水平的升高與腎小球濾過率下降所導(dǎo)致的瘦素清除減少有關(guān)；終末期腎衰患者脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)水平升高可能與慢性腎衰高瘦素血癥有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】  瘦素；基因表達(dá)；腎功能衰竭，慢性；炎癥；腎小球濾過率

　　0引言

　　瘦素（leptin）是由瘦素基因編碼的肽類激素，與嚙齒類動物及人類的食欲和能量代謝有關(guān)。 高濃度的瘦素可使食欲下降和能量消耗增加。 尿毒癥患者廣泛存在食欲下降和營養(yǎng)不良，但腎臟替代治療不能完全改善上述狀況，有研究認(rèn)為這與高瘦素血癥有關(guān)，而高瘦素血癥可能與腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）下降， 炎癥， 高胰島素血癥有關(guān)［1］， 但尿毒癥患者血清瘦素水平增加的真正原因卻仍在探討之中。 本研究旨在通過對慢性腎衰（chronic renal failure， CRF）患者血中瘦素水平及瘦素基因表達(dá)的變化進(jìn)行研究， 同時尋找引起這些變化的原因。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　150例患者中男89例，女61例， 均有不同程度腎損傷。 男性年齡（42±1）歲， 女性年齡（45±2）歲，其中原發(fā)性腎小球腎炎112例，慢性腎盂腎炎7例，多囊腎9例，糖尿病腎病17例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡5例。 所有患者觀察期間均停止使用類固醇及男性激素。 GFR<10 mL/min的患者采用血液透析治療，2~3次/wk，4 h/次，碳酸鹽透析液，血流量200~250 mL/min，透析液流量500 mL/min. 建議患者每日進(jìn)食蛋白量為1.0 g/kg，蛋白攝入量由尿素動力學(xué)控制，不控制日常能量攝入。 30例健康自愿者作為健康對照組，男17例，女13例，年齡（44±1）歲，體質(zhì)量指數(shù)相匹配。

　　1.2方法

　　①取血當(dāng)日測量身長、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）（BMI=體質(zhì)量÷身長2），所有測量均由一人完成。 ②在控制條件下，留24 h尿，于次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采靜脈血2 mL，在本院生化檢驗室檢測內(nèi)生肌酐清除率。 ③于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采靜脈血4 mL，血液透析患者透析前采血，取血后立即分離血清，置于-70℃冰箱中保存，待標(biāo)本集齊后一次檢測，檢測血清瘦素濃度應(yīng)用放射免疫分析法，試劑盒購于美國DSL公司。 一抗為兔抗人整分子瘦素的特異性多克隆抗血清，二抗為羊抗兔IgG血清。 ELISA方法檢測血清C反應(yīng)蛋白（Creactive protein，CRP）（試劑盒購于美國Biochech公司）。 熒光偏振免疫分析法檢測血清同型半光胺酸（total homocystein，tHcy）（試劑盒及熒光偏振免疫分析儀均為美國ABBOTT公司產(chǎn)品）。 IMMVLITE180化學(xué)發(fā)光儀檢測血清空腹胰島素水平（fasting insulin，F(xiàn)INS）。 ④脂肪組織的獲?。罕粶y者禁食8h，15例維持性血液透析的終末期腎衰（endstage renal disease，ESRD）患者，男8例，年齡（42.5±5.7）歲，女7例，年齡（38.7±7.8）歲，均在進(jìn)行腎移植手術(shù)切開腹部皮膚時取腹部脂肪2 cm3， 15例對照組均為腹腔鏡下行膽囊切除術(shù)患者，BMI與15例ESRD患者相匹配，在手術(shù)時取腹部皮下脂肪2 cm3，脂肪組織立即液氮運送，-80℃保存待測。 另各取脂肪組織0.5 cm3，福爾馬林固定，脫水后石蠟封存，待行免疫組化檢測。 ⑤瘦素基因檢測：用總RNA抽提試劑盒提取脂肪組織總RNA，操作步驟按說明書。 ⑥UltraSensitiveTM SP免疫組化法檢測脂肪瘦素的表達(dá)：將標(biāo)本石蠟塊作5 μm厚的連續(xù)切片， 烤片， 脫蠟至水， 微波修復(fù)； 加入一抗體溶液， 1∶100兔抗人瘦素多克隆抗體Ob（A20）（Santa Cruz，USA），二抗體溶液，即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒（鼠/兔）（KIT9710，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司），陽性顯色為棕色。 以PBS和一抗來源血清代替一抗作為陰性對照，以健康對照組腹部白色脂肪組織作為瘦素的陽性對照，每組切片隨機(jī)選取5個區(qū)域，每個區(qū)域包含100個同類細(xì)胞，計量陽性結(jié)果，取平均數(shù)作為每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。

　　統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用x±s表示。 組間比較采用方差分析或非參數(shù)秩和檢驗。 配對及組內(nèi)比較采用配對的t檢驗。 指標(biāo)間的相關(guān)性采用秩相關(guān)進(jìn)行分析。 P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

　　2結(jié)果

　　2.1腎臟患者瘦素、GFR和BMI的變化及相關(guān)性

　?、俨煌潭饶I功能損傷的150例患者，血清平均瘦素水平為（20.8±1.9） μg/L，高于健康對照（9.0±1.0） μg/L（P<0.01），與GFR（r=-0.26， P<0.01）及BMI（r=0.47， P<0.01）之間有相關(guān)性，而在GFR與BMI之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。 ②89例男性患者，血清平均瘦素（13.5±1.2） μg/L高于17例BMI相匹配的健康男性（4.7±0.4） μg/L （P<0.01），與GFR（r=-0.17， P<0.01）及BMI（r=0.56， P<0.01）之間有相關(guān)性，而GFR與BMI之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。 ③61例女性患者，血清平均瘦素水平（31.6±4.0） μg/L，高于13例BMI相匹配的健康女性（12.6±1.4） μg/L（P<0.01）。 與GFR（r=-0.44，P<0.01）及BMI（r=0.56，P<0.01）之間有相關(guān)性，而GFR與BMI之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。 ④正常GFR組（GFR>80 mL/min），中度腎功能損傷組（GFR 20~80 mL/min），重度腎功能損傷組（GFR<20 mL/min），中、重度腎功能損傷的2組血清瘦素水平明顯升高，分別為（16.9±1.5） ng/mL和（27.7±3.6） ng/mL，與健康對照組比較P<0.01. 腎功能正常組的瘦素水平（25.2±0.8） ng/mL與健康對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

　　2.2腎臟患者瘦素與CRP及tHcy，F(xiàn)INS的變化及相關(guān)性腎功能損傷不同階段的CRP，tHcy，F(xiàn)INS有變化（表1）。 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清瘦素與CRP（r=0.60， P<0.05），tHcy（r=0.57， P<0.05），F(xiàn)INS（r=0.60， P<0.05）之間呈正相關(guān)。表1不同程度腎功能衰竭患者tHcy，CRP和FINS的變化（略）

　　2.3ESRD患者瘦素基因表達(dá)及相關(guān)性

　　RTPCR顯示15例ESRD患者與15例健康對照組瘦素mRNA的相對表達(dá)水平：瘦素RTPCR產(chǎn)物為220 bp，βactinRTPCR產(chǎn)物為392 bp. 瘦素mRNA與βActin mRNA表達(dá)水平之比在兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異，前者瘦素mRNA相對表達(dá)水平為0.347±0.136低于后者0.489±0.102（P<0.01，圖1）。 15例ESRD患者中瘦素基因表達(dá)與血清瘦素水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.55，P<0.05），而CRP與瘦素基因表達(dá)之間無相關(guān)性（r=0.51， P=0.052）。

　　2.4脂肪組織免疫組化法

　　瘦素蛋白的表達(dá)免疫組化顯示15例ESRD組患者與15例健康對照組脂肪組織瘦素表達(dá)， 瘦素表達(dá)水平在兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異， 15例對照組脂肪組織有瘦素表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)為（35.37±14.89）%， 低于15例ESRD患者的瘦素陽性細(xì)胞數(shù)（61.70±22.96）%（P<0.05）。

　　3討論

　　我們研究顯示，中、重度腎功能衰竭患者血清痩素水平升高，高瘦素血癥可能與腎臟清除功能下降有關(guān)。 慢性腎衰患者高瘦素血癥可能通過反饋抑制使瘦素基因表達(dá)下降同時使脂肪組織瘦素蛋白表達(dá)增強(qiáng)。 人體脂肪增加及全身微炎癥狀態(tài)可能刺激瘦素產(chǎn)生增加。 高瘦素血癥可能與慢性腎衰患者胰島素抵抗有關(guān)。

　　瘦素通過其特異性受體及多種神經(jīng)肽通路作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響機(jī)體眾多生理活動和代謝途徑，抑制食欲，增加能量消耗、調(diào)節(jié)胰島素分泌、影響血管緊張素的作用、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能［2］。 目前有部分研究發(fā)現(xiàn)ESRD患者無論是否進(jìn)行透析其血清瘦素水平都進(jìn)行性增加，且患者的脂肪并沒有增加［3］，推測其食欲減退和營養(yǎng)不良與血清瘦素水平升高有關(guān)。 腎臟中有較高的瘦素短受體表達(dá)，和少量的長受體表達(dá)，瘦素可刺激腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞的增殖，給正常大鼠連續(xù)注射3 wk的瘦素可引起腎小球硬化和蛋白尿［2］，加速腎功能衰竭的發(fā)生。 循環(huán)中大于80%的瘦素經(jīng)腎臟排泄，血中的內(nèi)生瘦素可被腎小球快速濾過并由腎小管代謝降解，因此推測腎小球濾過率下降可能是瘦素水平升高的原因［4］。 Sharma等［5］檢測了正常腎功能及腎功能受損患者的腎動脈及腎靜脈的瘦素濃度，發(fā)現(xiàn)血液流經(jīng)正常腎臟時瘦素濃度有一定程度下降，凈排泄率為12％，而重度腎功能受損者凈排泄率為零，這再一次肯定了腎臟對瘦素的排泄作用［6］。 因此我們?nèi)哉J(rèn)為腎功能衰竭是瘦素水平增高的原因之一。

　　從本研究發(fā)現(xiàn)tHcy，CRP在中、重度腎功能衰竭患者中顯著升高。 且與瘦素水平呈正相關(guān)，這說明全身微炎癥狀態(tài)可能是造成CRF患者高痩素血癥的另一原因。 Nordfors等［7］研究認(rèn)為，在CRF患者中由于炎癥狀態(tài)可刺激瘦素基因表達(dá)，高瘦素血癥通過負(fù)反饋機(jī)制抑制瘦素基因表達(dá)，而炎癥可以破壞這種抑制。 但在我們的研究結(jié)果中CRP與瘦素基因表達(dá)之間并無相關(guān)性，這是否與病例的選擇及數(shù)量有關(guān)需進(jìn)一步研究。 對2型糖尿病患者的研究證實，胰島素抵抗患者胰島素水平增高直接導(dǎo)致血漿瘦素水平升高。 慢性腎功能衰竭時， 胰島素抵抗和高胰島素血癥普遍存在， 血漿胰島素水平高（>14 mU/L）的CRF患者與胰島素水平低的患者比較， 前者的血漿瘦素水平明顯高于后者［8］。 高瘦素血癥可能與尿毒癥患者胰島素抵抗有關(guān)。

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