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酶活性測定方法對比

2013-08-14 16:23 來源:
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1.按反應(yīng)時間分類法:20世紀50年代以前大都使用固定時間法。這種方法是以酶催化反應(yīng)的平均速度來計算酶的活性,現(xiàn)多已不用。50年代中期開始采用連續(xù)監(jiān)測法。這種方法用自動生化分析儀上完成,可以測酶反應(yīng)的初速度,其結(jié)果遠比固定時間法準確,在高濃度標本尤為明顯,但本法也受到反應(yīng)時間,反應(yīng)溫度,試劑等的影響,應(yīng)加以注意。

(1)定時法:(兩點法)

通過測定酶反應(yīng)開始后某一時間段內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求取酶反應(yīng)初速度的方法。其中t1往往取反應(yīng)開始的時間。

酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時間,通過加入強酸、強堿、蛋白沉淀劑等,使反應(yīng)完全停止(也叫中止反應(yīng)法)。加入試劑進入化學(xué)反應(yīng)呈色測出底物和產(chǎn)物的變化。

該法最基本的一點是停止反應(yīng)后才測定底物或物的變化。

優(yōu)點:簡單易行,對試劑要求不高。

缺點:難保證測定結(jié)果的真實性。

難以確定反應(yīng)時間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。隨著保溫時間的延續(xù),酶變性失活加速。

(2)連續(xù)監(jiān)測法:又稱為動力學(xué)法或速率法、連續(xù)反應(yīng)法。

在酶反應(yīng)過程中,用儀器監(jiān)測某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物濃度隨時間的變化所發(fā)生的改變,通過計算求出酶反應(yīng)初速度。

連續(xù)監(jiān)測法根據(jù)連續(xù)測得的數(shù)據(jù),可選擇線性期的底物或產(chǎn)物變化速率用于計算酶活力。

因此連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性比定時法更準確。

實際工作中,采用工具酶的酶偶聯(lián)法已經(jīng)成為應(yīng)用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

(3)平衡法:通過測定酶反應(yīng)開始至反應(yīng)達到平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法,又叫終點法。

2.按檢測方法分類法:

①分光光度法;

②旋光法;

③熒光法;

④電化學(xué)方法;

⑤化學(xué)反應(yīng)法;

⑥核素測定法;

⑦量熱法

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