動力學(xué)法測定酶的活性濃度
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總單位時間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物增加的量。
在t2-t1時間內(nèi)吸光度的變化與所測物質(zhì)濃度成正比。
實際操作中,測定兩個固定時間的吸光度差值,只要此期間待測物消耗<5%,就可以采用標準濃度對照法計算樣本濃度,所以動力學(xué)法有時又稱為固定時間法。
與終點法相比,動態(tài)法測定中待測物無須完全轉(zhuǎn)化,故工具酶的用量較少,為了保證有足夠的測定線性,所用酶的Km應(yīng)足夠大。如所用工具酶Km太小,可在反應(yīng)體系中加入競爭性抑制劑,以加大Km。
動力學(xué)法對于測定儀器的要求更嚴格,動態(tài)法由于測定反應(yīng)動態(tài)過程中的吸光度,檢測的信號小,溫度對測定的影響很大,這要求儀器的電噪聲小,吸光度應(yīng)讀準到0.0001,溫度變化<0.1%。
終點法可受到乳糜、黃疸和溶血的影響,測定時需設(shè)定樣品空白。
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