時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA），跟著小編來(lái)學(xué)習(xí)一下吧！

用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨。

（一）基本原理

1.時(shí)間分辨

正常組織在激發(fā)光照射下可以發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，但該熒光壽命較短（1～10ns），而鑭系元素螯合物的熒光壽命較長(zhǎng)（10～1000μs）。故待短壽命背景熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素離子螯合物的特異性熒光信號(hào)。

2.Stokes位移：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長(zhǎng)差，如果Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑭系元素位移大。

3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜：鑭系元素發(fā)射光譜帶較窄，多在613nm±1Onm。利用濾光片只允許此波段的熒光通過(guò)，避免干擾。

4.熒光標(biāo)記物的相對(duì)比活性：比活性是指單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)標(biāo)記分子可被探測(cè)到的信號(hào)量。

5.信號(hào)增強(qiáng)

Eu3＋標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物在弱堿性溶液中被激發(fā)后的熒光信號(hào)較弱，加入一種酸性增強(qiáng)液可使Eu3＋從復(fù)合物上完全解離下來(lái)，并與另一種螯合劑所螯合，以增強(qiáng)熒光信號(hào)。

（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法

1.標(biāo)記物：多用Eu3＋和Tb3＋為標(biāo)記物，其中Eu3＋最為常用。

2.標(biāo)記方法：鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體結(jié)合，需應(yīng)用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑，其一端與鑭系元素離子結(jié)合，另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合。

（三）方法類型

1.雙抗夾心法：待檢抗原與固相抗體結(jié)合，再與Eu3+標(biāo)記抗體結(jié)合，在酸性環(huán)境下，復(fù)合物上的Eu3+解離下來(lái)，在340nm激發(fā)光照射下，形成熒光。

2.固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法：待檢抗原和Eu3＋標(biāo)記的抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，熒光強(qiáng)度與待檢抗原成反比。

3.固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法：待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)Eu3＋標(biāo)記抗體，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。

（四）方法評(píng)價(jià)

1.優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高；分析范圍寬；標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，有效使用期長(zhǎng)；測(cè)量快速，易自動(dòng)化；無(wú)放射性污染。

2.缺點(diǎn)：

易受環(huán)境、試劑和容器中的鑭系元素離子的污染，使本底增高。

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