實(shí)驗(yàn)室及其他檢查

　　一、醋酸白試驗(yàn)用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗(yàn)的原理是蛋白質(zhì)與酸凝固變白的結(jié)果，HPV感染細(xì)胞產(chǎn)生的角蛋白與正常的未感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗(yàn)檢測HPV的敏感性很高，它比常規(guī)檢測觀察組織學(xué)變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現(xiàn)假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規(guī)則。美國CDC提示，醋酸白試驗(yàn)并不是特異試驗(yàn)，且假陽性較常見。

　　二、免疫組織學(xué)檢查常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內(nèi)的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時(shí)，尖銳濕疣的淺表上皮細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)淡紅色的弱陽性反應(yīng)。

　　三、組織化學(xué)檢查取少量病損組織制成涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結(jié)合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強(qiáng)且較迅速，對診斷有幫助。

　　四、病理檢查主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細(xì)胞和基底細(xì)胞并有相當(dāng)數(shù)量的核分裂、頗似癌變。但細(xì)胞排列規(guī)則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點(diǎn)為粒層和刺層上部細(xì)胞有明顯的空泡形成。此種空泡細(xì)胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細(xì)胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發(fā)展之傾向，則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。

　　五、基因診斷迄今，HPV難于用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測，主要實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)是核酸雜交。近年來發(fā)展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，為HPV檢測開辟了新途徑。

　?。ㄒ唬?biāo)本的采集及處理1、標(biāo)本的采集和預(yù)處理：

　　用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞。在作細(xì)胞學(xué)檢查的同時(shí)，將標(biāo)本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mlPBS中，取0.5ml細(xì)胞懸液抽提DNA. 2、標(biāo)本核酸的提?。?/P>

　　按1體積細(xì)胞懸液加10倍體積的細(xì)胞裂解液（10mmol/L　Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜；且等體積酚/氯仿（1：1），氯仿/異戊醇（24：1）各抽提2次；加1/10體積3mol/L　NaAc（pH 5.2）及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶（100μg/ml）的TE液（10mmol/L　Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA）溶解DNA，37℃溫育30min.（二）PCR擴(kuò)增1、引物設(shè)計(jì)和合成：

　　HPV基因組可分為早期區(qū)（E）和晚期區(qū)（L），每區(qū)含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區(qū)及E1、E6、E7和L1區(qū)均有保守序列。Manos等從HPVL1區(qū)中選擇保守序列設(shè)計(jì)合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補(bǔ)序列，也可擴(kuò)增其它型HPV. Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1通用引物MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC 2、PCR反應(yīng)試劑：

　　Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液（500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5），100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。

　　3、PCR擴(kuò)增方法和程序：

　　以100μl PCR反應(yīng)液，用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

　　（1）實(shí)驗(yàn)前配制預(yù)混反應(yīng)試劑并分裝。預(yù)混反應(yīng)試劑包括除標(biāo)本DNA外的其它各種PCR反應(yīng)試劑。

　?。?）各反應(yīng)管依次加入10μl標(biāo)本和90μl預(yù)混反應(yīng)試劑。

　?。?）加入80-100μl石蠟油，在臺(tái)式離心機(jī)上快速離心數(shù)秒鐘，使各反應(yīng)試劑收集于油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl.使用時(shí)只加入標(biāo)本DNA即可。

　　（4）將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，循環(huán)參數(shù)為95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環(huán)35次，最后72℃延伸5min. 4、每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質(zhì)粒（每反應(yīng)為100pg）或含有HPV的細(xì)胞系（如Caski、HeLa）DNA為陽性對照，以無HPV的人細(xì)胞系DNA為陰性對照。

　?。ㄈU(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析1、凝膠電泳：

　　擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結(jié)果，分子量約為450bp處出現(xiàn)明顯的DNA帶。

　　2、核酸雜交：

　　如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時(shí)，可用標(biāo)記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。

　　按照標(biāo)準(zhǔn)方法制32P ATP標(biāo)記的寡核苷酸探針，需達(dá)到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml.在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨后于30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速?zèng)_洗雜交膜，除去多余探針。然后進(jìn)行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，并換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。

　　用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優(yōu)越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結(jié)果，可檢出標(biāo)本中200個(gè)拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測PCR產(chǎn)物，敏感性提高，能檢出10個(gè)拷貝的HPV DNA.鑒于PCR技術(shù)的高度敏感性，以生殖道脫落細(xì)胞為檢材足以滿足試驗(yàn)要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，觀察產(chǎn)生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術(shù)檢測HPV實(shí)驗(yàn)周期短、簡便快速。

　　診斷

　　診斷要點(diǎn)：

　　1、不潔性交史。

　　2、典型皮損為生殖器或肛周等潮濕部位出現(xiàn)丘疹，乳頭狀、菜花狀或雞冠狀肉質(zhì)贅生物，表面粗糙角化。

　　3、醋酸白試驗(yàn)陽性，病理切片可見角化不良及凹空細(xì)胞。

　　4、核酸雜交可檢出HPV-DNA相關(guān)序列，PCR檢測可見特異性HPV-DNA擴(kuò)增區(qū)帶。

　　鑒別診斷

　　一、生殖器鱗癌；多見于40歲以上或老年人，皮損向下浸潤，發(fā)生潰瘍，組織病理有特征性改變。

　　二、扁平濕疣：為多個(gè)濕丘疹融合成片狀的皮損，多見于肛周，皮損處可查到梅毒螺旋體，梅毒血清試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)。

　　三、珍珠狀陰莖丘疹?。簽檠毓跔顪吓帕校橆^及粟粒大小的皮色或淡粉紅色丘疹。組織病理無凹空細(xì)胞。

　　四、假性濕疣；損害為局限于小陰唇的粟粒大呈魚卵狀淡紅色小丘疹或絨毛狀改變，皮損表面光滑，醋酸白試驗(yàn)陰性，病理上無具有診斷意義的凹空細(xì)胞。

　　五、鮑溫樣丘疹??；為棕紅色或色素性小丘疹，組織病理可見異型鱗狀細(xì)胞及類似原位癌的組織象。

　　治療

　　由于目前沒有特效的抗病毒藥物，尖銳濕疣的治療必須采用綜合治療。

　　一、治療誘因如白帶過多，包皮過長、淋病等。提高機(jī)體免疫力。應(yīng)用抗病藥物。一般只要堅(jiān)持規(guī)則的綜合治療都可治愈。

　　二、手術(shù)療法對于單發(fā)、面積小的濕疣，可手術(shù)切除；對巨大尖銳濕疣，可用Mohs氏手術(shù)切除，手術(shù)時(shí)用冷凍切片檢查損害是否切除干凈。

　　三、物理治療1、冷凍療法利用-196℃低溫的液體氮，采用壓凍法治療尖銳濕疣，促進(jìn)疣組織壞死脫落，本法適用于數(shù)量少，面積小的濕疣，可行1-2次治療，間隔時(shí)間為一周。

　　2、激光治療通常用CO2激光，采用燒灼法治療尖銳濕疣，本療法最適用女陰、陰莖或肛周的濕疣。對單發(fā)或少量多發(fā)濕疣可行一次性治療，對多發(fā)或面積大的濕疣可行2-3次治療，間隔時(shí)間一般為一周。

　　3、電灼治療采用高頻電針或電刀切除濕疣。方法：局部麻醉，然后電灼，本療法適應(yīng)數(shù)量少，面積小的濕疣。

　　4、微波治療采用微波手術(shù)治療機(jī)，利多卡因局麻，將桿狀輻射探頭尖端插入尖銳濕直達(dá)疣體基底，當(dāng)看到就體變小、顏色變暗、由軟變硬時(shí)，則熱輻射凝固完成，即可抽出探頭。凝固的病灶可以用鑷子挾除。為防止復(fù)發(fā)，可對殘存的基底部重復(fù)凝固一次。

　　5、β-射線治療我們應(yīng)用β-射線治療尖銳濕疣取得了較為滿意的效果，該方法療效高，無痛苦、無損傷、副作用少，復(fù)發(fā)率低，在臨床上有推廣價(jià)值。

　　四、藥物療法1、足葉草脂：

　　本療法適用濕潤區(qū)域的濕疣，例如發(fā)生于包皮過長而未曾作包皮環(huán)切除手術(shù)的龜頭及會(huì)陰部的濕疣。但對宮頸尖銳濕疣不能用足葉草脂治療。用20%足葉草脂酊劑涂到皮損處或用藥前，先有油質(zhì)抗菌藥膏保護(hù)皮損周圍的正常皮膚或粘膜，然后涂藥，用后4-6小時(shí)，用30%硼酸水或肥皂水清洗，必要時(shí)3天后重復(fù)用藥，該藥是國外用于本病治療的首先藥，一般用一次可愈。但有很多缺點(diǎn)，如對組織破壞性大，使用不當(dāng)可引起局部潰瘍。毒性大，主要表現(xiàn)為惡心、腸梗阻、白細(xì)胞及血小板減少，心動(dòng)過速、尿閉或少尿，故使用時(shí)必須謹(jǐn)慎，發(fā)現(xiàn)上述反應(yīng)時(shí)，應(yīng)立即停藥。

　　2、抗病毒藥：

　　可用5%酞丁胺霜?jiǎng)?，或?.25%皰疹凈軟膏，每日2次，外涂。無環(huán)鳥苷口服，每日5次，每次200mg，或用其軟膏外用，α-干擾素每日注射300萬單位，每周用藥五天?；蚋蓴_素300萬單位注入疣體基部，每周2次。連用2-3周，主要副作用為流感樣綜合癥，局部用藥副作用較少且輕微。

　　3、腐蝕劑或消毒劑：

　　常用有30%-50%三氯醋酸或飽和二氯醋酸，或18%過氧乙酸。用10%水楊酸冰醋酸或40%甲醛、2%液化酚、75%乙醇蒸餾水100ml混合溶液，點(diǎn)涂局部，用于龜頭、肛周濕疣，每日或隔日一次，效果甚好。消毒劑可用20%碘酊外涂，或2.5-5%碘酊注射于疣體基部，每次0.1-1.5ml，或用新潔爾滅外涂或以0.1-0.2%外敷，后者需配合全身療法。

　　4、抗癌藥① 5-氟脲嘧啶（5-F u）：

　　一般外用5%軟膏或霜?jiǎng)咳?次，3周為一療程。2.5%~5%氟脲嘧啶濕敷治療陰莖、肛周尖銳濕疣，每次敷20分鐘，每日一次，6次為一療程。也可用聚乙二醇作基質(zhì)，加入占其干質(zhì)5%的5-Fu粉劑制成栓劑，治療男女尿道內(nèi)尖銳濕疣，也可用5- F u基底注射，多者可分批注射。

　　② 噻替哌：

　　主要用于5-F u治療失敗的尿道內(nèi)尖銳濕疣，每日用栓劑（每個(gè)含15mg），連用8天，也可將本品60mg加入10-15ml消毒水中，每周向尿道內(nèi)滴注，保持半小時(shí)，副作用有尿道炎。亦可用本品10mg加入10ml浸泡患處，每日3次，每次半小時(shí)，治療陰莖、龜頭冠狀溝濕疣，主要用于經(jīng)其它方法治療后，尚有殘存疣體或復(fù)發(fā)者。也可將此溶液再稀釋兩倍浸泡局部，以預(yù)防復(fù)發(fā)。

　?、?秋水仙鹼：

　　可用2-8%的生理鹽水溶液外涂，涂兩次，間隔72小時(shí)治療陰莖濕疣，涂后可出現(xiàn)表淺糜爛。

　?、?爭光霉素或平陽霉素：

　　用0.1%的生理鹽水溶液作皮損內(nèi)注射，每次總量限制在1毫升（1mg），大多一次可愈。平陽霉素為爭光霉素?fù)Q代品，用法基本相同，亦有用平陽霉素10mg溶于10%普魯卡因20ml內(nèi)注射。

　　5、免疫療法① 自體疫苗法：用病人自己的疣體組織勻漿（融冷滅活病毒），并進(jìn)行加熱處理（56℃一小時(shí)）收集上清液注射，可用于頑固性肛周濕疣。

　?、诟蓴_素誘導(dǎo)劑：可用聚肌胞及梯洛龍。聚肌胞每日注射2 ml，連用10天，停藥1-2月后，再繼續(xù)用藥。梯洛龍每日3次，每次300mg，停藥4天，或隔日口服600 mg.③ 干擾素、白介Ⅱ，靈桿菌素，利百多聯(lián)合應(yīng)用，療效較佳。

　　預(yù)防

　　控制性病是預(yù)防CA的最好方法。發(fā)現(xiàn)治療患者及其性伴；進(jìn)行衛(wèi)生宣教和性行為的控制；陰莖套具有預(yù)防HPV感染的作用，目前尚無有效疫苗。