以往的實(shí)驗(yàn)室檢查有梅毒螺旋體檢查，梅毒血清試驗(yàn)和腦脊液檢查。隨著基因診斷技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)應(yīng)用檢測(cè)梅毒螺旋體DNA，使梅毒的診斷變得準(zhǔn)確、快速、敏感。

　　一、梅毒螺旋體檢查（一） 檢查方法1、暗視野顯微鏡檢查：在皮損處，用玻片刮取組織滲出液或淋巴結(jié)穿刺液，見有活動(dòng)的梅毒螺旋體。

　　2、免疫熒光染色：在熒光顯微鏡下可見綠色的梅毒螺旋體。

　　3、活體組織檢查梅毒螺旋體，如用銀染色法（Warthin-starry）法或（Levoaditis法）或熒光抗體染色，可查見梅毒螺旋體，呈黑褐色，有螺旋結(jié)構(gòu)，位于真皮毛細(xì)血管周圍。銀染色的陽(yáng)性結(jié)果需謹(jǐn)慎解釋，因?yàn)轭愃泼范韭菪w的其他物質(zhì)易混淆。而特異性熒光檢查則更為可靠。

　?。ǘ┞菪w的鑒別鏡下檢查梅毒螺旋體與雅司、地方性梅毒、品他三種非性病性螺旋體鑒別，此外還應(yīng)與齒大螺旋體、齒小螺旋體、軟螺旋體、生殖器螺旋體相鑒別。

　　1、雅司、地方性梅毒、品他三種非性病螺旋體：形態(tài)上不能與梅毒螺旋體相區(qū)別，但流行病學(xué)、病史、臨床表現(xiàn)可以鑒別；

　　2、齒大螺旋體：為疏螺旋體，比梅毒螺旋體長(zhǎng)，存在于口腔中，尤其在齒縫內(nèi)最多；

　　3、齒小螺旋體：比梅毒螺旋體短，旋距也短，運(yùn)動(dòng)不規(guī)則，兩端較中部略寬。主要見于齒垢中；

　　4、軟螺旋體：為疏螺旋體，螺旋較少，運(yùn)動(dòng)不規(guī)律且快，常不斷改變其形態(tài)。寄生于皮膚潰瘍中。

　　5、生殖器螺旋體：比梅毒螺旋體短小，螺旋體大而不規(guī)則，生于陰垢內(nèi)，不經(jīng)常清洗者檢出率較高。

　　6、其他：與螺旋形網(wǎng)狀纖維、纖維蛋白細(xì)絲、纖毛、串狀紅細(xì)胞等呈螺旋狀的物體相鑒別。

　　二、梅毒血清試驗(yàn)根據(jù)所用抗原不同，梅毒血清試驗(yàn)分為以下兩大類：

　?。ㄒ唬┓敲范韭菪w抗原血清試驗(yàn)用心磷脂作抗原，測(cè)定血清中抗心磷脂抗體，亦稱反應(yīng)素。本試驗(yàn)敏感性高而特異性較低，且易發(fā)生生物學(xué)假陽(yáng)性。早期梅毒患者經(jīng)充分治療后，反應(yīng)素可以消失，早期未經(jīng)治療者到晚期，部分病人中反應(yīng)素也可以減少或消失。目前一般作為篩選和定量試驗(yàn)，觀察療效，復(fù)發(fā)及再感染。

　　1、性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL）

　　用心磷脂、卵磷脂及膽固醇為抗原，可作定量及定性試驗(yàn)，試劑及對(duì)照血清已標(biāo)準(zhǔn)化，費(fèi)用低。此法常用，操作簡(jiǎn)單，需用顯微鏡讀取結(jié)果，缺點(diǎn)是一期梅毒敏感性不高。

　　2、快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn)（Rapid Plasma reagin test， RPR）

　　是VDRL抗原的改良，敏感性及特異性與VDRL相似，優(yōu)點(diǎn)是肉眼即可讀出結(jié)果。

　　3、不加熱血清反應(yīng)素玻片試驗(yàn)（Unheated Serum Reagin USR）

　　也是VDRL抗原的改良，敏感性及特異性與VDRL相似。

　　（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)用活的或死的梅毒螺旋體或其成分來(lái)作抗原測(cè)定抗螺旋體抗體。這種試驗(yàn)敏感性和特異性均高，一般用作證實(shí)試驗(yàn)。這種試驗(yàn)是檢測(cè)血清中抗梅毒螺旋體IgG抗體，即使患者經(jīng)過足夠治療，仍能長(zhǎng)期存在，甚至終身不消失，血清反應(yīng)仍持續(xù)存在陽(yáng)性，因此，不能用于觀察療效。

　　1、熒光梅毒螺旋抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS Test）：此法是較敏感和較特異的螺旋體試驗(yàn)。

　　2、梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA）：敏感性和特異性均高，操作簡(jiǎn)便，但對(duì)一期梅毒不如FTA-ABS試驗(yàn)敏感。

　　3、梅毒螺旋體制動(dòng)試驗(yàn)（Treponema Pallidum immobilization ，TPI）；用Nichol株螺旋體（活的）加病人血清（含抗體）后，在補(bǔ)體的參與下可抑制螺旋體的活動(dòng)。如≥50%梅毒螺旋體停止活動(dòng)，則為陽(yáng)性。此試驗(yàn)特異性、敏感性均高，但設(shè)備要求高，操作難，僅供研究用。

　　三、基因診斷技術(shù)檢測(cè)梅毒螺旋體梅毒螺旋體不能進(jìn)行體外培養(yǎng)。檢測(cè)臨床標(biāo)本中梅毒螺旋體最敏感、可靠的方法是兔感染試驗(yàn)（RIT），RIT能證實(shí)活的梅毒螺旋體存在，是檢測(cè)梅毒螺旋體常用的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而用RIT對(duì)新生兒或成人梅毒進(jìn)行常規(guī)診斷不切合實(shí)際。梅毒的血清學(xué)診斷對(duì)確定感染及治療很有意義，但對(duì)早期梅毒診斷不敏感，對(duì)先天性及神經(jīng)性梅毒的診斷不夠特異。血清學(xué)試驗(yàn)用作先天性梅毒的輔助診斷，其首要問題是將無(wú)癥狀感染嬰兒從非感染嬰兒區(qū)別開來(lái)，這些嬰兒的母親梅毒血清試驗(yàn)陽(yáng)性，困難在于不能將母親體液免疫反應(yīng)同嬰兒的抗體反應(yīng)相區(qū)別，因?yàn)槟赣H的IgG可傳遞給胎兒。另外由于IgG終身存在，所以很難評(píng)價(jià)治療結(jié)果。血清學(xué)診斷常常又存在著假陽(yáng)性。CR檢測(cè)梅毒螺旋體DNA，特異性很強(qiáng)，敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進(jìn)方法。

　　（一）PCR引物的設(shè)計(jì)部位與序列：

　　目前有四套擴(kuò)增梅毒螺旋體DNA的系統(tǒng)：擴(kuò)增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），擴(kuò)增39KDa堿性膜蛋白基因（bmp基因），擴(kuò)增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和擴(kuò)增tmpA基因。

　　三種擴(kuò)增系統(tǒng)的引物序列：

　　47-1 CACAATGCTCACTGAGGATAGT 648-669 47-2 ACGCACAGAACCGAATTCCTTG 1284-1035 Tpp47-3 TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC 713-734 47-4 TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT 1187-1208 TP3 CAGGTAACGGATGCTGAGT 256-275 TP4 CGTGGCAGTAACCGCAGTCT 762-741 bmpTP5（探針） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519 TP7 CTCAGCACTGCTGAGCGTAG 172-191 TP8 AACGCCTCCATCGTCACACC 788-769 F1 CTCTTCAAGGAGCTCAT 222-206 Tpf-1F2 AGACAGTGGTTATGCTC 77-61或tyf-1F3（探針）ATTGCGCCAGCATGTAG 114-130 F4（探針）ATTGCGCCGGCATGTAG 114-130

　　（二）操作方法1、采集標(biāo)本，根據(jù)病人的情況可采取局部分泌物，抽取淋巴結(jié)液，羊水，血清，腦脊液。用適量的蒸餾水稀釋，保存于4℃冰箱。

　　2、標(biāo)本處理：目的是為了暴露梅毒螺旋體的DNA，消除標(biāo)本對(duì)PCR的抑制物。采用下列處理方法。

　?、僦蠓蟹ǎ喝?0或20μl血清或CSF放入0.5ml微量離心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷卻，13000g離心10s，上清用作PCR分析。

　　②低速離心法：將100μl羊水，血清或腦脊液加入到900μl無(wú)菌磷酸緩沖液中，10000g室溫離心10min，上清轉(zhuǎn)入另外的微量離心管中，20000g4℃離心1h，棄上清，沉淀懸浮于50μl無(wú)菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷卻，取40μl上清作PCR.③堿裂解法：取收集標(biāo)本100μl加于含1mol/L NaCl，1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min，用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl（pH8.0）中和。用相同體積的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整個(gè)600μl的溶液用相同體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，然后用相同體積的異丙醇沉淀（-20℃過液）。13000g4℃離心15min，輕輕倒出上清，涼干。沿淀懸浮于51μl無(wú)菌水中，取20μl作PCR模板。

　　（三）PCR擴(kuò)增1、擴(kuò)增47KDa膜抗原基因100ml反應(yīng)物含：10mmol/L TrisHCl（pH8.3），50mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，100μg/ml明膠，0.5μg引物（47-1和47-2），75mmol/LdNTPs，2.5U TaqDNA聚合酶。取不同量各種制備的DNA作模板，反應(yīng)過程：94℃15s，60℃1min， 72℃1min，循環(huán)40次，末次循環(huán)增加72℃10min延伸時(shí)間，取10ml反應(yīng)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。點(diǎn)雜交分析產(chǎn)物：取10mlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中變性10min，用380μ11.5mol/L NaCl-1mmol/L Tris（pH7.2）中和，然后用Minifold I點(diǎn)膜，80℃真空處理膜2h，用496bp探針65℃雜交過夜。探針為引物47-3和47-4的PCR產(chǎn)物，用隨機(jī)引物法標(biāo)記. 2、擴(kuò)增39KDa堿性膜蛋白基因25μ1反應(yīng)體系含：1×RT緩沖液，50mmol/L Tris-HCl（pH8.5），50mmol/LNaCl，4mmol/LMgCl2，2mmol/L DTT（二硫基蘇糖醇），200μmol/L dNTP，100μmol/L引物（TP7和TP8），0.01%牛血清白蛋白（無(wú)DNase和RNase），1UTaqDNA聚合酶，5μ1樣品，可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增強(qiáng)PCR. PCR1：先用引物TP7和TP8擴(kuò)增出617bp片段，反應(yīng)過程：94℃3min后進(jìn)入循環(huán)過程：94℃1min，65℃1min，72℃1min，循環(huán)數(shù)為30或35，每一循環(huán)中72℃延伸遞增5s，最后一次延伸時(shí)間延長(zhǎng)到6min. PCR2：再用巢居引物TP3和TP4擴(kuò)增出500bp片段，PCR1產(chǎn)物用蒸餾水稀釋10倍，取5μ1用作第二次擴(kuò)增.PCR2中MgCl2和引物濃度分別為5mmol/L和20μmol/L引物（TP3和TP4），其它條件與PCR1相同。

　　PCR產(chǎn)物分析。①取10μ1反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳；②Southern印跡后，用寡核苷酸探針TP5（以32P作末端標(biāo)記）雜交。

　　3、擴(kuò)增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因100μ1反應(yīng)物含：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl（pH8.4），2.5mmol/L MgCl2，0.2mg/ml明膠，1μmol/L dNTP，2mmol/L引物（F1和F2），2.5UTaqDNA聚合酶，10μ1經(jīng)處理的兔睪丸梅毒螺旋體懸液，反應(yīng)過程：94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2.5min，循環(huán)40次，取10μ1PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Southern印跡后，用tpf-1特異的探針F3和tyf-1特異物的探針F4分別雜交。

　　為使擴(kuò)增效率達(dá)到最大，反應(yīng)參數(shù)應(yīng)選擇最佳數(shù)值。使用大片段雙股DNA探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物，而不用合成的寡核苷酸探針，因?yàn)檫@樣可通過標(biāo)記得到較高、特異的放射活性。另外，大片段探針能最大減少野生株tpp47可變序列的假陰性結(jié)果及由于Taq DNA聚合酶的錯(cuò)誤導(dǎo)致堿基替代的假陰性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：PCR的敏感性確能達(dá)到檢測(cè)單一tpp47拷貝的水平。

　　由于臨床標(biāo)本可能含有大量人細(xì)胞和微生物，建立對(duì)梅毒螺旋體高度特異的PCR方法是很重要的。盡管大量數(shù)椐支持47Da膜抗原基因及其相應(yīng)基因具梅毒螺旋體特異性，還應(yīng)深入研究該方法的特異性。在EB染色的瓊脂糖凝膠偶而可見非特異的PCR產(chǎn)物，（如擴(kuò)增淋病奈氏球菌）時(shí)就需要用tpp47特異的探針雜交來(lái)增加特異性及敏感性。僅從梅毒螺旋體梅毒亞種和雅司亞種染色體DNA獲得了特異的PCR產(chǎn)物，表明了病原性螺旋體非常相近的親緣關(guān)系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。擴(kuò)增tpp47不能如常規(guī)法那樣能區(qū)分梅毒螺旋體和伯氏疏螺旋體，在用血清學(xué)試驗(yàn)診斷梅毒和萊姆疾病時(shí)，這兩種螺旋體有交叉反應(yīng)。

　　梅毒螺旋體梅毒亞種 tpf-1基因在123位置為A，雅司亞種tpf-1基因在123位置為G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特異的寡核苷酸探針（兩種探針僅一個(gè)核苷酸不同）檢測(cè)不同菌株tpf-1或tpf-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明：不能根據(jù)tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同來(lái)區(qū)別梅毒亞種。這些菌種從梅毒患者分離，一些已用兔傳代多次，通過對(duì)新鮮臨床標(biāo)本中梅毒螺旋體DNA的分析比較，以上結(jié)果可能是由于梅毒螺旋體在傳代中點(diǎn)突變所致。

　　四、 腦脊液檢查用于診斷神經(jīng)性梅毒，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)，蛋白量，VDRL試驗(yàn)、PCR檢測(cè)、膠體金試驗(yàn)等。為除外無(wú)癥狀神經(jīng)梅毒，所有梅毒病人凡病期超過一年者均應(yīng)作腦脊液檢查。所有早期胎傳梅毒嬰兒也應(yīng)檢查腦脊液以除外中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的可能。腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白量的增加屬非特異性變化，腦脊液VDRL試驗(yàn)才是神經(jīng)梅毒的較可靠診斷依據(jù)。但是，當(dāng)有活動(dòng)的神經(jīng)梅毒存在時(shí)，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)常增高（WBC＞5/mm3），因此，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)也常常是判斷療效的敏感指標(biāo)。有條件的單位行腦脊液PCR檢測(cè)，可以快速準(zhǔn)確的診斷神經(jīng)性梅毒。

　　五、 梅毒血清反應(yīng)的假陽(yáng)性技術(shù)性假陽(yáng)性：抗原敏感性過高，血清標(biāo)本弄錯(cuò)或溶血或細(xì)菌污染，檢查室技術(shù)不熟練。

　　生物學(xué)假陽(yáng)性：非螺旋體抗原血清試驗(yàn)陽(yáng)性率高于螺旋體抗原血清試驗(yàn)。前者是檢測(cè)的病人的反應(yīng)素，后者是檢測(cè)抗梅毒螺旋體抗體。由于非螺旋體試驗(yàn)所用抗原也存在于其他組織，所以其他疾病甚至偶見正常人也出現(xiàn)反應(yīng)素，因此在某些疾病中發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，針對(duì)梅毒而言稱為假陽(yáng)性反應(yīng)。

　　1、急性生物學(xué)假陽(yáng)性：

　　這些疾病在6個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)陰。見于麻疹、水痘、風(fēng)疹、傳染性單核細(xì)胞增多癥、上呼吸道感染、猩紅熱、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、肺炎球菌性肺炎、活動(dòng)性肺結(jié)核、絲蟲病、斑疹傷寒、錐蟲病、回歸熱、鉤端螺旋體、瘧疾，但滴度很低，一般在1：8以下，當(dāng)用螺旋體抗原血清FTA-ABS或TPHA試驗(yàn)檢測(cè)，血清反應(yīng)陰性。PCR檢測(cè)陰性。

　　2、慢性生物學(xué)假陽(yáng)性，可持續(xù)6個(gè)月以上或數(shù)年，甚至終身，可分為兩類：

　?。?）非螺旋體抗原血清試驗(yàn)假陽(yáng)性；這些疾病常見于自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、播散性盤狀紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性心臟病、肝硬化、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、干燥綜合征、慢性腎炎及海洛因成癮，滴度可達(dá)1∶64～1∶128；少數(shù)孕婦，正常人群假陽(yáng)性率為1%-2%.在70歲以上高齡老人中有1%出現(xiàn)假陽(yáng)性。

　?。?）螺旋體抗原血清假陽(yáng)性；發(fā)生率比非螺旋體抗原血清試驗(yàn)少，雖有部分其他病的患者出現(xiàn)FTA-ABS假陽(yáng)性，其熒光染色常很弱或呈不典型的“串珠狀”。

　　（3）梅毒血清反應(yīng)的假陰性a.一期梅毒硬下疳：一般硬下疳出現(xiàn)2-3周，機(jī)體才出現(xiàn)反應(yīng)素，故早期血清反應(yīng)常呈陰性。

　　b.感染梅毒立即治療或晚期梅毒：由于血清反應(yīng)素低，出現(xiàn)陰性。

　　c.二期梅毒假陰性；不到1%的二期梅毒患者其未稀釋的血清VDRL試驗(yàn)呈陰性或弱陽(yáng)性反應(yīng)，而在高度稀釋后反而為陽(yáng)性，即前帶現(xiàn)象（Prozone phenomenon），這是血清中抗心磷脂抗體過多，抑制陽(yáng)性反應(yīng)的結(jié)果。

　　d.技術(shù)操作或抗原敏感性低出現(xiàn)血清試驗(yàn)陰性。